Возможные ошибки в дизайне клинических исследований и интерпретации их результатов

Для выяснения причин противоречивости данных о действии антиоксидантов при их использовании в кардиологической практике необходимо более подробно рассмотреть некоторые теоретические проблемы, которые, с нашей точки зрения, не учитываются как при планировании подобных исследований, так и при трактовке их результатов.

Подмена понятий и терминологическая путаница при интерпретации результатов исследований. В проведенных исследованиях чаще всего использовали комплексы витаминов-антиоксидантов, включающие витамин Е, витамин С и провитамин А в различных соотношениях. Тем не менее при обсуждении результатов исследований, в которых положительный эффект отсутствовал, обычно говорится не о низкой эффективности конкретного антиоксидантного комплекса, а об отсутствии антиатерогенного действия у антиоксидантов вообще. Аналогичным образом, обсуждение результатов применения определенного вещества (например, витамина Е) зачастую заканчивается общим выводом о низкой эффективности антиоксидантов; при этом вновь происходит подмена понятий — «негативные»^[3] результаты исследования конкретного вещества распространяются на всю разнородную группу соединений, проявляющих антиоксидантные свойства в различных (иногда только в строго определенных) модельных системах. Однако даже представители малочисленной группы природных жирорастворимых антиоксидантов весьма сильно различаются как по строению молекул, так и по механизму действия [121, 147]. Так, механизм антирадикального действия фенольного антиоксиданта α-токоферола, «ловушки радикалов», резко отличается от механизма антиокислительного действия изопреновых соединений — β-каротина и других каротиноидов [74, 121, 147]. С другой стороны, основной механизм действия водорастворимого антиоксиданта аскорбиновой кислоты сводится к ее участию в ферментзависимой регенерации радикальных форм фенольных антиоксидантов [121, 147].

Авторы клинических работ допускают также и другие терминологические неточности, что, в конечном итоге, может приводить к значительной путанице. Так, обычно

R - остаток уксусной или янтарной кислоты

Рис. 13. Ферментативный гидролиз и антиоксидантные свойства эфиров α-токоферола

пишут об использовании α-токоферола^[4], хотя все фармакологические фирмы выпускают препараты витамина Е не в виде свободного α-токоферола, а в виде химически более стабильных форм — сложных эфиров типа α-токоферилацетата или α-токоферил- сукцината. Следует, однако, понимать, что в отличие от свободного α-токоферола его эфиры не являются антиоксидантами, поскольку при реакции со свободным радикалом должен происходить отрыв атома водорода от свободной ОН-группы при углеродном атоме хроманового ядра этого фенола, что становится невозможным после этерификации [74, 121, 147] (рис. 13). Таким образом, препараты, содержащие витамин Е, формально антиоксидантами не являются и могут проявлять антиокислительное действие в организме теплокровных только после разрыва сложноэфирной связи панкреатической или печеночной карбоксиэфиргидролазами, которые с различной скоростью гидролизуют разные эфиры α-токоферола [820, 980]. Поскольку сведения об эффективности ферментативного гидролиза эфиров α-токоферола у обследуемых больных отсутствуют, остается только гадать, насколько потенциальная антиоксидантная активность препаратов витамина Е будет реализована in vivo в организме конкретного пациента.

ных клинических трайлах. Понимание этого уже привело японских исследователей к необходимости создания национального референс-стандарта для α-токоферилацетата [800]. Очевидно, что правильность выбора оптимального соотношения компонентов в комплексном препарате витаминов-антиоксидантов, способного обеспечить высокую антирадикальную активность in vivo, нуждается в экспериментальных доказательствах как в специальных исследованиях на модельных системах, так и в экспериментах на животных или при клинических испытаниях [98].

Следует отметить, что другой компонент комплексных препаратов, природный антиоксидант β-каротин (провитамин А), после всасывания в кишечнике подвергается ферментативной конверсии в ретинол (витамин А), антиоксидантная активность которого выше, чем у β-каротина [147, 1045]. Тем не менее, по полученным нами данным [47] активность осуществляющего конверсию β-каротина фермента β-каротин-15,15'- диоксигеназы существенно зависит от обеспеченности организма антиоксидантами и ингибируется при интенсификации свободнорадикального окисления.

Больше — не всегда лучше, или Концентрационная инверсия антиоксидантного эффекта. При определении оптимальной терапевтической дозы препаратов, включающих витамины-антиоксиданты, следует учитывать возможность инверсии антиоксидантного действия in vivo, как это было продемонстрировано нами на примере β-кароти- на [124]. Провитамин А (β-каротин) представляет собой изопреноидное соединение, содержащее систему из четырех конъюгированных двойных связей, вследствие чего он, как полиеновый липид, способен легко окисляться по свободнорадикальному механизму [398] и, таким образом, может выступать в роли прооксиданта, провоцирующего свободнорадикальное окисление других ненасыщенных липидов в биомембранах. Тем не менее β-каротин также способен непосредственно взаимодействовать со свободными радикалами [398] и ингибировать радикальное окисление различных субстратов [398, 495]. При этом механизм антиоксидантного действия β-каротина отличен от механизма действия «классических» антиоксидантов фенольной структуры, таких как α-токоферол, и состоит, вероятно, в образовании малоактивных углерод-центрирован- ных резонансных радикалов в изопреноидной цепи при взаимодействии с активными радикалами органических гидропероксидов [398].

Результаты работ по применению β-каротина в клинике весьма неоднозначны [1171, 1244, 1270], что вполне объяснимо, исходя из теоретических представлений [398, 495] и полученных нами данных [124].

Рис. 14. Концентрационная инверсия антиоксидантного действия β-каротина in vivo. На рисунке представлено изменение антиоксидантного потенциала печени и миокарда крыс (продолжительность лаг-фазы при аскорбатзависимом окислении гомогенатов тканей) после ежедневного перорального введения различных доз провитамина А (β-каротина) в течение 30 дней; заштрихованные области — границы 95-процентного доверительного интервала для контрольных животных [124]

Концентрационная инверсия, вероятно, характерна и для других витаминов-антиоксидантов. Так, α-токоферол способен провоцировать прооксидантный эффект вследствие образования инициирующих свободнорадикальное окисление α-токофе- роксильных радикалов [362, 1569]. Аскорбат также обладает антиоксидантным и про- оксидантным действием в биологических системах, восстанавливая α-токофероксиль- ные радикалы или регенерируя участвующие в образовании АКМ ионы Fe³+ и Cu²+ [121, 147]. Следует отметить, что для всех перечисленных веществ, включая β-каротин, инверсия антиоксидантного действия в прооксидантное происходит при переходе от более низких концентраций вещества в системе к более высоким, что может представлять опасность при передозировках, тогда как во многих клинических трайлах использовали преимущественно аномально высокие дозы β-каротина [398, 1171, 1244, 1270].

Значение исходного антиоксидантного статуса организма. Можно полагать, что исходный антиоксидантный статус организма является чрезвычайно важным, если не определяющим, фактором при прогнозе эффективности антиоксидантной терапии у конкретного индивидуума. Очевидно, что регулярный прием препаратов, содержащих витамины-антиоксиданты и антиоксидантные элементы, с целью повышения антиоксидантного статуса организма и снижения опасности возникновения свободнорадикальных патологий вполне оправдан, особенно для жителей России, у которых при эпидемиологических обследованиях выявлен существенный дефицит природных антиоксидантов [200] (табл. 9). Не вызывает сомнений, что наличие дефицита витами-

Таблица 9

Необеспеченность витаминами-антиоксидантами населения России (по данным эпидемиологических исследований, проведенных Институтом питания РАМН [200])

нов-антиоксидантов у россиян необходимо учитывать при планировании клинических исследований с интервенцией антиоксидантов в различных регионах Российской Федерации, при этом дозы вводимых антиоксидантов, очевидно, могут несколько превышать обычные дозы, необходимые для удовлетворения суточной потребности. До начала проведения подобных трайлов представляется необходимым иметь объективные сведения о состоянии основных систем, ответственных за регуляцию процессов свободнорадикального окисления (низкомолекулярные антиоксиданты и антиоксидантные ферменты) для каждого включенного в исследование больного. К сожалению, в настоящее время не существует общепринятых биохимических тестов, которые могли бы однозначно охарактеризовать антиоксидантный статус конкретного пациента. Тем не менее в соответствии с нашим опытом важные сведения в этом отношении могут быть получены при анализе концентрации первичных и вторичных продуктов свободнорадикального окисления липидов в плазме крови (предпочтительнее — в ЛНП), а также при определении активности ключевых антиоксидантных ферментов в форменных элементах крови [123, 972, 973]. Во всяком случае, даже использование только этих биохимических тестов позволяет более корректно планировать исследования, связанные с интервенцией антиоксидантов и с большей обоснованностью трактовать получаемые результаты [123, 972, 973]. Таким образом, без биохимического тестирования изменений антиоксидантного потенциала конкретного пациента корректная оценка клинического эффекта антиоксидантов представляется невозможной.

О критериях выбора антиоксидантов для клинических исследований. Отсутствие ощутимых успехов при применении витаминов-антиоксидантов в ряде клинических исследований, вероятно, не исчерпывается оговоренными выше причинами. Действительно, есть основания полагать, что исходные теоретические предпосылки этих работ не учитывают последних достижений в области биохимии атеросклероза. Так, в завершенном недавно наиболее тщательно подготовленном клиническом трайле MRC/BHFHeart Protection Study [734] авторы исходили из того, что уменьшение окисляемости ЛНП должно привести к подавлению прогрессирования атеросклероза у больных ИБС, при этом оценка результатов в исследовании, длившемся в течение 5 лет, базировалась исключительно на анализе статистики числа умерших от сердечно-сосудистых заболеваний и/ или частоты их осложнений. Для подавления окислительной модификации ЛНП in vivo больные получали ежедневно 900 МЕ витамина Е, что превышает суточную потребность в этом витамине в 30 (sic!) раз. Осведомленный отечественный комментатор, не утруждая себя какой-либо научной аргументацией, авторитетно заявляет, что подобные дозы «с любой» (sic!) точки зрения следует признать «вполне достаточными» [52].

К сожалению, наш собственный опыт, равно как и анализ доступной литературы не дают оснований для столь безаппеляционных заключений. Так, отнюдь не малая доза витамина Е (600 МЕ/сут.), использованная в наших исследованиях, не оказала достоверного влияния на медь-инициированную окисляемость ЛНП in vitro (основной критерий для выбора дозы витамина Е в клинических трайлах) [973] (табл. 10). Эти результаты в целом соответствуют данным и других авторов [827, 1172], согласно ко-

Таблица 10

Изменение продолжительности лаг-фазы медь-индуцированного свободнорадикального окисления ЛНП после приема больными ИБС d-a-токоферилацетата в суточной дозе 600 МЕ (n = 29) [973]

* Отличия от исходных значений недостоверны (Р < 0,05).

торым дозы витамина Е порядка 200—400 МЕ/сут. являются малоэффективными при ингибировании свободнорадикального окисления ЛНП. Тем не менее, в других работах достоверное подавление Си²+-медиированного окисления ЛНП in vitro наблюдали при использовании суточных доз витамина Е порядка 500—1500 МЕ/сут. и выше [1172, 1392]. Из этого следует, что правильный выбор «вполне достаточной» дозы витамина Е на основании используемого критерия (подавление окисления ЛНП in vitro) не является вполне надежным и, вероятно, сильно зависит от исходного антиоксидантного статуса организма пациента. Кроме того, как было сказано выше, существует определенная опасность применения аномально высоких доз витамина Е, поскольку при этом весьма вероятным является накопление токофероксильных радикалов, способных инициировать свободнорадикальное окисление, т. е. провоцировать окислительный стресс [362, 1569].

Несмотря на то, что циркулирующие в плазме крови ЛНП являются α-токофе- рол-транспортирующими частицами [121, 147, 1643], эффективную защиту ЛНП от свободнорадикального окисления, как полагают в настоящее время, осуществляет не α-токоферол, а восстановленная форма убихинона Q₁₀ — убифенол Q₁₀ [1038, 1569]. Это теоретическое положение объясняет неоднократно экспериментально подтвержденный факт, что надежно снизить окисляемость ЛНП удается только при использовании аномально высоких доз витамина Е, более чем на порядок превышающих суточную потребность [827, 973, 1172, 1392]. В то же время в соответствии с нашими данными [123, 973] введение больным убихинона Q₁₀ резко снижает окисленность ЛНП in vivo даже в условиях прооксидантного действия лекарственных препаратов. Таким образом, при планировании проведенных клинических трайлов выбор антиоксидантов для снижения окисляемости ЛНП был сделан без учета достижений фундаментальных исследований последних лет [123, 973, 1569]. Следовательно, можно полагать, что использование витамина Е в качестве антиатерогенного препарата еще недостаточно обосновано, тогда как применение убихинона Q₁₀ в качестве эффективного антиоксиданта при ИБС и атеросклерозе может быть чрезвычайно перспективным.