Методы экспериментального изучения сроков развития и выживаемости яиц гельминтов в окружающей среде
При изучении сроков развития и выживаемости яиц гельминтов требуется проведение специальных экспериментов с искусственной закладкой проб на различных объектах окружающей среды. Опыты необходимо проводить, C одной стороны, B условиях, наиболее приближающихся к естественным, а с другой — при которых пробы с яйцами гельминтов сохранялись бы в окружающей среде и их легко было бы извлекать для исследования в любые сроки.
Ha поверхности почвы закладку яиц гельминтов проводят одним из следующих способов:
а) на предварительный фильтр наносят не менее 1000 яиц гельминтов и покрывают его другим таким же фильтром; края
фильтров загибают конвертами, после чего их укладывают на полосы плотного мельничного газа и прошивают. Расстояние между соседними фильтрами должно быть не менее 10 см, чтобы при извлечении конца ленты и забора для исследования j—2 фильтров не нарушать другие; мельничный газ с пробами укладывают на поверхность опытного участка, а затем отбирают пробы для исследования;
б) на поверхности участка в почву на глубину 2—3 см вдавливают кювету из металлической сетки так, чтобы ее края были на 2—3 мм выше поверхности почвы. Кювету засыпают исследуемой почвой и забрызгивают взвесью яиц гельминтов (из расчета не менее 1000 на 1 см2). И в том, и в другом случае пробы для исследования отбирают: весной и осенью 1 раз в 10 сут, летом через 3—5 сут, зимой 1—2 раза в месяц.
При изучении сроков выживаемости яиц гельминтов в почве на разных глубинах (5, 10, 20, 40, 60 см) закладку их целесообразно проводить в специальных пробах р?оманенко H.A., 1982].
B опытах применяют яйца тех видов гельминтов, которые представляют наибольшую эпидемиологическую опасность в данной местности. Если нужно установить максимальные сроки выживаемости яиц гельминтов, целесообразно ставить опыты с яйцами аскарид. При этом могут быть использованы яйца как Asc.
lumbricoides, так и Asc. suum, полученные из рогов матки аскариды, прилегающих к вагине не далее 1—1,5 см, а также из фекалий.Получение чистой взвеси яиц аскарид. Порцию фекалий (1 столовая ложка) помещают в центрифужную пробирку объемом 50— 250 мл (лучше в пробирку объемом 250 мл) и заливают водопроводной водой (30—120 мл), после чего смесь тщательно размешивают стеклянной палочкой до образования гомогенной массы и центрифугируют в течение 2—3 мин при скорости 800 об/мин. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют такую же порцию чистой воды; смесь снова размешивают и центрифугируют.
Промывание повторяют не менее 2—3 раз. После промывания к осадку добавляют насыщенный раствор натрия хлорида (плотность 1,2), смесь размешивают, всплывшие крупные частицы снимают, а смесь центрифугируют 2—3 мин; затем снимают петлей с поверхности раствора пленку. Эти операции повторяют до тех пор, пока в контрольной капле, взятой на предметное стекло, будут попадаться лишь единичные яйца гельминтов. Затем начинают второй этап — выделение яиц гельминтов из слабого раствора соли.
Содержимое сосудов отстаивают в течение 2—3 ч, после чего надосадочную жидкость сливают, а осадок фильтруют через 4—5 слоев марли или мелкоячеистую сетку на часовые стекла диаметром 10 -15 см. Легкими круговыми движениями производят закручивание осадка к центру часового стекла, а оставшуюся по периферии жидкость отсасывают пастеровской пипеткой с резиновой грушей. Ha часовые стекла добавляют небольшое количество водопроводной воды, смесь снова размешивают и закручивают к центру стекла; такую операцию повторяют до тех пор, пока на стекле не будет чистая взвесь яиц гельминтов. Наблюдение за чистотой взвеси яиц гельминтов проводят под микроскопом. Чистую взвесь яиц гельминтов переносят в стеклянные бюксы с крышкой, этикетируют и помещают на хранение в холодильник. Р.Э.Чобанов и др. (1986) рекомендуют промывать 200 г фекалий на сетке с отверстиями диаметром 1 мм2 (для отделения грубых частиц).
Смывные воды центрифугируют со скоростью 1000 об/мин, осадок переносят в специальный аппарат, а точнее в основной сосуд аппарата, до краев заполненный 40 % раствором натрия хлорида, и закрывают крышкой. Через воронку доливают раствор так, чтобы уровень его поднялся на 2—3 см выше основания трубки. Нагнетая воздух, перегоняют жидкость через трубку в воронку, откуда она вновь поступает в основной сосуд. При этом яйца отделяются от фекалий и с током жидкости достигают воронки, где вследствие разной плотности их и солевого раствора концентрируются на поверхности. Содержимое воронки сливают в стаканчик, разбавляют водой из расчета 1:5 и оставляют на 2 ч для оседания яиц. Уже через 1,5 ч работы аппарата из фекалий выделяется более половины всех яиц.Приготовление тестюбъектов. Из алюминия или другого мягкого металла толщиной 1—2 мм вырезают прямоугольную пластинку размером 6x6 см; по всей ее поверхности делают отверстия диаметром 2—3 мм на расстоянии 4—5 мм друг от друга; пластинку сворачивают трубкой диаметром 2 см. Для этого могут быть использованы алюминиевые бигуди, применяемые для завивки волос. Такой каркас удобен тем, что со всех сторон доступен для почвенного воздуха, влаги почвы; кроме того, он можетдолго пролежать в земле, а при выкапывании предохраняет пробу почвы от разрушения. Каркас взвешивают, набивают исследуемой почвой и снова взвешивают, а затем по разности полученных показателей определяют массу почвы.
Через отверстия в каркасе в почве делают несколько углублений (в разных местах), в которые и вносят с помощью пипеток необходимое количество капель раствора с культурой яиц гельминтов так, чтобы на 1 г почвы в тест-объекте их было не менее 1000. Среднее количество яиц гельминтов в одной капле определяют следующим образом: на предметное стекло наносят 5—10 капель хорошо перемешанной взвеси яиц гельминтов. Под микроскопом подсчитывают их количество в каждой капле, суммируют и делят на число капель.
Необходимое длЯ внесения в тест-объект количество капель определяют по предлагаемой нами формуле:
(P1 — P„) X 1000
--------------------------------------------- 1----- U---------
K
где n — число капель суспензии из яиц гельминтов; P0 — масса упаковки-контейнера без почвы; P1 — масса упаковкиконтейнера с почвой; K — среднее число яиц гельминтов в 1 капле; 1000 — содержание яиц гельминтов в 1 г почвы после обсеменения.
После внесения яиц гельминтов в пробу почвы углубления в каркасе забивают такой же чистой почвой. Тест-объект заворачивают в мельничный газ, после чего к нему приУрепляют проволоку длиной на 5—10 см больше глубины закладки их в почву. После помещения тест-объектов в почву на концах проволоки, выведенных наружу, устанавливают опознавательные знаки. Лучше всего пробы (тест-объекты) готовить в лаборатории и хранить до постановки опыта в холодильнике.
Для закладки тест-объектов на выбранных участках выкапывают ямы шириной 1—1,2 м. Длину их рассчитывают в каждом конкретном случае отдельно (в зависимости от количества испытуемых проб). Ha дно ям укладывают пробы (тест-объекты) на расстоянии 20—30 см друг от друга; ямы засыпают сначала той почвой, которая выбрасывалась последней при подготовке ям; на поверхности полученных грядок устанавливают опознавательные знаки.
Количество тест-объектов должно быть рассчитано на длительный период наблюдения (7—10 лет), выемку их для исследования производят B зависимости от климата, характера почвы и глубины закладки —- не реже 1 раза в месяц при исследовании тест-объектов с глубины до 20 см и не реже 1 раза в квартал при болёе глубоких закладках. Учитывая, что тест-объекты для исследования можно забирать (для средней полосы России) только с апреля по октябрь, т.е. в течение 7 мес, легко подсчитать число тест-объектов, необходимое для закладки на ту или иную глубину (на глубину 5, 10, 20 см в среднем 49—70 штук; на глубину 40 и 60 см 21—30 штук).
По опознавательным знакам определяют места нахождения тест- объектов, выкапывают ямы размером 30X30 см так, чтобы между стенкой ямы и ближайшим тест-объектом был оставлен слой почвы толщиной не менее 10 см. Изъятые из почвы тест-объекты помещают в пакеты из бумаги или целлофана и доставляют в лабораторию для исследования. При определении стадии развития или признаков деформации в каждом опыте необходимо просматривать не менее 100—200 яиц гельминтов.
Для изучения сроков развития и выживаемости личинок анкило- стомид и стронгилоидов в почве рекомендуется следующая методика: фекалии, содержащие яйца анкилостомид, смешивают с почвой в пластмассовых кюветах, на дне которых просверлены отверстия; кюветы помещают в почву экспериментальных участков на 7— 10 сут и ежедневно ведут забор fipo6 обсемененной почвы для исследования по методу Бермана.
Поиск проводят до тех пор, пока вылупившиеся из яиц личинки не достигнут инвазионной стадии, а затем погибнут.Для изучения выживаемости яиц гельминтов B воде (метод Е.П.Разу- мовой и А.С.Артамошина, 1969) несколько капель насыщенной взвеси яиц гельминтов (не менее 1000) наносят пипеткой на предварительные планктонные фильтры, сложенные воронками. Для устойчивости воронки помещают в штатив из небольшой.картонной крышки, в которой сделаны ячейки. После внесения яиц края воронок загибают и вместе с этикетками, указывающими даты и номера опытов, помещают по 2—3 экземпляра в стеклянные трубки. Наиболее удобными являются трубки длиной около 7 см, диаметром 2 см с небольшими раструбами, за которые с обеих сторон закрепляют сатин при завязывании отверстий трубок.
B металлическую сетку заворачивают по 3—4 трубки и на капроновом шнуре опускают их в воду. Если пробы намечено поставить в местах с быстрым течением воды, для удержания проб на необходимой глубине к сетке подвешивают дополнительный груз. Серия из 3— 4 трубок, связанных вместе, составляет 1 опыт. Часть трубок подвешивают у дна, остальные — на различном расстоянии от него. Для просмотра берут по 1 трубке из каждого опыта. Подсчитывают не менее 200 яиц, смытых с фильтра на предметное стекло.
Изучение сроков развития и выживаемости яиц гельминтов на овощах проводят следующими методами.
1. Яйца гельминтов (не более 1000) наносят непосредственно на овощи. Сроки их нахождения на овощах определяют временем роста последних. Эти овощи помечают, а через нужное время забирают на исследование. Яйца гельминтов очищают скальпелем с поверхности овощей на фильтр и помещают во влажную камеру для развития их в оптимальных лабораторных условиях. Наблюдения показали, что яйца гельминтов на овощах, не защищенных листьями, смываются дождем. Поэтому взвесь яиц гельминтов на овощи целесообразно помещать на фильтрах.
2. Яйца гельминтов (не менее 1000), наносят на предварительные фильтры, последние с помощью ниток крепко фиксируют на поверхности овощей. Для исследования берут не менее 3 фильтров, в каждом из которых просматривают не менее 200—300 яиц гельминтов, определяя стадию их развития или признаки деформации.