Введение Актуальность темы
Склеродермия - хроническое заболевание неизвестной этиологии, сопро- вождающееся нарушениями клеточного иммунитета, микроциркуляции и по- вышенным коллагенообразованием [Баткаев Э.А., 2004].
На современном этапе патогенез склеродермии рассматривается как сложное взаимодействие повре- ждения и дисфункции эндотелиальных клеток, воспаления, аутоиммунных ре- акций и активации фибробластов. Однако причины гиперпродукции коллагена при склеродермии в настоящее время остаются до конца не изученными. Ре- зультаты многих исследований показали, что ключевую роль в фенотипических изменениях при склеродермии играет трансформирующий фактор роста β [Higley H. et al., 1994]. В образцах кожи, полученных из очагов поражения пу- тем биопсии, выявлен повышенный синтез TGF-β1. Также четко показано уве- личение числа рецепторов к фактору в области очагов склеродермии, что свиде- тельствует о повышенной активности TGF-β1 при данной патологии [Ihn et al., 2001]. Кроме того в исследованиях in-vitro была выявлена корреляция между увеличением числа рецепторов к фактору и повышением уровня матричной РНК α-цепей коллагена I типа [Kubo et al., 2001].Для разработки подходов к диагностике и лечению аутоиммуных патоло- гий необходимо находить критические звенья патологического процесса. Учи- тывая нарушение регуляции генетического аппарата у таких пациентов, с этой целью перспективным остается применение методов молекулярной биологии с исследованием генов-кандидатов и их белковых продуктов, участвующих в ключевых патогенетических механизмах. В качестве генов-кандидатов принято выбирать те гены, уровень экспрессии которых существенно изменен, а также те транскрипционные факторы которые влияют на экспрессию больших групп генов.
Протеины семейства белка активатора-1 (AP-1), связывающие ДНК промо- терных участков генов и регулирующие их экспрессию, играют ключевую роль в регуляции синтеза коллагена I типа, инициируемого TGF-β.
Установлено, чтосегмент промотера гена коллагена I типа, с которым связывается транскрипци- онный фактор AP-1, расположен в пределах участка связывания TGF-β [Liska et al., 1990; Slack et al., 1995]. Индуцированная мутация данного участка промоте- ра приводила к практически полной потере ответа на воздействие трансформи- рующего фактора роста [Chung et al., 1995]. Также, по всей вероятности система AP-1 участвует в пролиферации фибробластов при склеродермии за счет изме- нения регуляции уровня циклина E [Shaulian et al., 2001]. Транскрипционный фактор ATF (Activating transcription factor) является одним из образующих ком- понентов транскрипционного комплекса AP-1 (Activating protein 1), который во- влечен в ряд важнейших процессов в клетках. Исследования показали, что ATF участвует в регуляции TGF-β-зависимой экспрессии генов синтеза компонентов межклеточного матрикса, при этом активация ATF-2 осуществяется двумя пу- тями: прямым - путем непосредственного связывания Smad3 и путем фосфори- лирования TGF-β-активированной киназой-1 (ТАК-1 киназой) [Sano et al., 1995]. Кроме того ATF-4 является одним из ключевых факторов, участвующих в клеточном ответе на оксидантный стресс, составляющий одно из звеньев пато- генеза склеродермического процесса, путем биосинтеза глутатиона [Rutkowski et al., 2003].
Гены AP-1 задействованы в воспалении и контроле клеточного цикла, опо- средованно участвуют в процессах пролиферации, морфогенеза, апоптоза и дифференцировки клеток. Многие AP-1-зависимые гены кодируют другие транскрипционные факторы, цитокины, их рецепторы и ферменты, ответствен- ные за метаболизм межклеточных сигнальных молекул. Данные свойства си- стемы AP-1 позволили рассмотреть ее гены в качестве генов-кандидатов, участ- вующих в различных заболеваниях кожи, что было продемонстрировано у па- циентов с псориазом [Hess et al., 2004; Пирузян Э.С., 2007]. При детальном изу- чении сигнальных путей, запускаемых провоспалительными цитокинами, было выявлено общее увеличение экспрессии генов, активирующихся различными путями, после связывания рецептора цитокина и его лиганда, в частности AP-1.
Также при сравнении экспрессии генов в очагах поражения и образцах здоро-вой кожи было установлено увеличение экспрессии с-Fos, c-Jun и JunB в 10-20 раз в биоптатах бляшек в сравнении с непораженными участками кожи [Пиру- зян и др., 2007]. У пациентов с системным склерозом было выявлено усиление экспрессии генов JunD и Fra-2, а нокаутирование фибробластов по данным ге- нам приводило к резкому снижению синтеза коллагена на базовом уровне и на фоне стимуляции TGF-β [Palumbo et al., 2011; Reich et al., 2009].
Таким образом, рассматривая систему AP-1 как компонент регуляции син- теза коллагена на генном уровне, можно сделать предположение о ее непосред- ственном участии в патогенезе склеродермического процесса. В связи с этим особую актуальность приобретает оценка экспрессии генов в бляшках у паци- ентов с очаговой склеродермией. Результатом изучения генетических особенно- стей регуляции коллагенообразования может стать углубление представлений о формировании и прогрессировании склеродермии с возможным в дальнейшем расширением возможностей его патогенетически обоснованного лечения.
В этом плане теоретические предпосылки для применения при ОС имеют- ся у препарата такролимус, который является макроциклическим лактоном [Kroft et al., 2009]. Такролимус ингибирует фосфотазу кальцинейрина, MAP ки- назы JNK и p38, и таким образом препятствует задержке T-клеток в G0 фазе за счет активации ядерных транскрипционных факторов NFAT и AP-1, вызывая иммуносупрессивный эффект [Barbarino et al., 2013]. При этом в мировой лите- ратуре имеются лишь единичные сведения о применении такролимуса при ле- чении больных ограниченной склеродермией. Все выше перечисленное опреде- лило цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования:
Научное обоснование целесообразности применения такролимуса у паци- ентов с очаговой склеродермией на основе изучения характера экспрессии генов транскрипционных факторов системы белка активатора-1 (AP-1).
Задачи исследования:
1 .Изучить изменение экспрессии генов семейств Fos, Jun, ATF системы AP-1 в очагах поражения у пациентов с очаговой склеродермией в сравнении с интактной кожей.
2 .В сравнительном аспекте изучить влияние применения мази такролимус 0.1% на степень выраженности клинических симптомов очаговой склеродермии по данным динамики индекса дерматологического статуса mLoSSI.
3 .Оценить влияние препарата такролимус 0,1% на качество жизни у больных очаговой склеродермией
4 .Оценить терапевтическую эффективность применения препарата такролимус
0,1% у больных очаговой склеродермией.
Научная новизна
В работе впервые проведено изучение экспрессии генов системы белка ак- тиватора-1 у пациентов с очаговой склеродермией c помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Для оценки изменений функцио- нирования данных генов в пределах патологических очагов с помощью того же метода исследована экспрессия генов AP-1 в клинически неизмененной коже тех же больных. На основании результатов исследования доказано, что у боль- ных очаговой склеродермией отмечается активация генов всех семейств систе- мы AP-1 в пораженных участках, за исключением гена FRA-1. Результаты ис- следования позволяют утверждать об участии генов системы AP-1 в патогенезе очаговой склеродермии, при этом максимальное увеличение экспрессии отме- чается у гена фактора ATF-4 (4,7±2 раза по сравнению с непораженной кожей), что свидетельствует об участии оксидантного стресса в развитии склеродермии и обосновывает применение препаратов, влияющих на систему АР-1.
Впервые в результате количественного анализа детально изучена связь между динамикой клинического течения и клиническими формами очаговой склеродермии, а также особенностями экспрессии генов транскрипционных факторов семейств Jun, Fos и ATF, в результате чего было доказано, что повы-
шение экспрессии генов отмечается независимо от стадии патологического процесса, при этом четкой связи между максимальными показателями экспрес- сии генов и количеством очагов поражения не наблюдается.
Впервые на основании данных динамики индекса активности склеродер- мии mLoSSI и его составляющих (эритемы и степени инфильтрации очага), а также индекса качества жизни пациентов доказана высокая терапевтическая эффективность наружной терапии препаратом такролимус 0,1%, патогенетиче- ское действие которого включает влияние на экспрессию транскрипционных факторов АР-1.
Результатами исследования показано, что у большинства паци- ентов отмечалась достоверно значимая положительная динамика индекса ак- тивности склеродермии mLoSSI, при этом полная ремиссия наблюдалась у больных с эритематозной стадией формирования бляшек. Доказано, что лечение такролимусом является более эффективным методом терапии (70,0%), по срав- нению с топическими глюкокортикоидами (32,5%).В работе доказано более выраженное, по сравнению со стандартной терапией положительное влияние терапии такролимусом на качество жизни (ДИКЖ) пациентов с очаговой склеродермией.
Практическая значимость работы и внедрения:
В работе продемонстрирована диагностическая ценность показателей экспрессии генов транскрипционных факторов семейств Jun, Fos и ATF для оценки активности процесса при очаговой склеродермии. Результаты исследо- вания способствуют оптимизации терапевтических мероприятий у больных очаговой склеродермией. Предложенный новый подход к терапии данной пато- логии позволяет повысить эффективность лечения и улучшить комплаентность пациентов и может быть рекомендован для широкого применения в различных лечебно-профилактических учреждениях дерматологического профиля.
Установленные в работе сведения о закономерностях экспрессии генов системы AP-1 у больных с очаговой склеродермией могут быть использованы в лекционных курсах на кафедрах кожных и венерических болезней, а также в соответствующих пособиях и руководствах.
Результаты работы внедрены в практику консультативно-поликлиническо- го отделения Московскрго Научно-практического Центра Дерматовенерологии и Косметологии и дерматологического отделения Государственного учреждения здравоохранения Тульский областной кожно-венерологический диспансер .
Личный вклад автора
Автором подготовлен обзор данных отечественных и зарубежных ис- точников литературы по теме исследования, сформулированы цель и задачи диссертационной работы. Разработан дизайн исследования и индивидуальная регистрационная карта больного в соответствие, с которой проведено клинико- анамнестическое обследование и сформирована база экспериментальных дан- ных.
Автором проведено непосредственное лечение пациентов. Проведена ста- тистическая и описательная обработка полученных данных клинических методов обследования и специальных методов исследования. Проведен анализ результа- тов работы, по которым опубликованы статьи, тезисы и написана диссертация с формулировкой основных выводов, вытекающих из проделанной работы. Пред- ложены практические рекомендации по использованию алгоритмов диагностики склеродермии и применению разработанной методики терапии.Основные положения, выносимые на защиту
1. У больных очаговой склеродермией происходит активация генов всех семейств системы AP-1 в пораженных участках по сравнению с клинически интактной кожей, за исключением гена FRA-1. Максимальное увеличение экспрессии отмечается у гена фактора ATF-4 (4,7±2 раза по сравнению с непораженной кожей), являющегося компонетом антиоксидантной системы, что свидетельствует об участии оксидантного стресса в развитии склеродермии.
2. Повышение экспрессии генов отмечается независимо от стадии патологического процесса, при этом четкой связи между максимальными показателями экспресии генов и количеством очагов поражения не наблюдается.
3. Использование препарата такролимус 0,1% у больных очаговой с к л е р од е рм и е й в ы з ы в а е т в ы с о к и й к л и н и ч е с к и й э ф ф е к т, ч т о сопровождается регрессом клинической симптоматики и улучшением качества жизни пациентов.
Апробация диссертации:
Материалы диссертации доложены на:
- 7 Международном форуме Дерматовенерологов и косметологов» (Москва, 2013),
- 22d EADV Congress Istanbul, Turkey (October 2013),
- XXXI Научно-прaктической конференции с междунaродным учaстиeм
«Рaхмaновские чтения: иммунозависимые дермaтoзы» (Москвa, 2014). Апробация работы состоялась на совместном заседании Лаборатории по изучению репаративных процессов в коже НИО Иммунозависимых дерматозов ПМГМУ им. И.М. Сеченова и Кафедры кожных и венерических имени В.А. Рахманова лечебного факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения РФ 30 мая 2013г.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 5 в журналах рекомендованных ВАК.
Публикации:
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 5 в журна- лах, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации:
Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выво- дов, практических рекомендаций и библиографического указателя, содержаще- го 26 отечественных и 179 иностранных источников. Работа иллюстрирована 24 рисунками, 25 таблицами и 11 фотографиями больных.