Дозирование жидкостей в асептических условиях — специфический процесс микробиологических производств

В настоящее время для промышленного микробиоло­гического синтеза, осуществляемого в аппаратах перио­дического и непрерывного действия, характерно все бо- 168 лее широкое использование технических устройств и си­стем, предназначенных для дозированного введения раз­личных стерильных жидкостей и чистых культур микро­организмов.

Отмечается, что для большого класса микроорганиз­мов — продуцентов антибиотиков в практику все шире внедряются способы ферментации с непрерывным дози­рованием легкоокисляемых углеводов [26]. Однократ­ная подача углеводов или даже подача раздельными порциями не обеспечивает достаточной скорости био­синтеза антибиотика (по сравнению с непрерывной по­дачей). Поскольку скорость подачи углеводов влияет на такой технологический параметр, как их концентра­ция в среде, естественно при изучении физиологии микро­организмов находить зависимость между этим парамет­ром и скоростью биосинтеза антибиотика. В реальных условиях, возникающих при непрерывном дозировании углеводов в ходе процесса, скорость их потребления на­столько высока, что, несмотря на непрерывную подачу, в среде культивирования обнаруживают лишь следы углеводов. В то же время связь между скоростью дози­рования углеводов и их концентрацией в среде неодно­значна и определяется концентрацией биомассы, ее воз­растом, величиной pH и др. На примере пенициллина показано, что на продуктивность влияют микроконцен­трации глюкозы в среде. Для роста характерна зависи­мость от концентрации глюкозы в виде кривой с насы­щением. Продуктивность мицелия снижается при увели­чении концентрации глюкозы.

Процесс, при котором в популяцию микроорганизмов непрерывно подаются питательные вещества без удале- 169

ния клеток, можно назвать циклически питаемым про­цессом культивирования. В определенных условиях по­лучаемые культуры имеют характеристики, сходные с характеристиками культур, растущих в хемостате. Наи­более существенное сходство между двумя системами состоит в том, что удельная скорость роста клеток мо­жет регулироваться объемной скоростью подачи пита­тельных веществ в ферментатор. В обеих системах, как правило, имеется один компонент питательной смеси, концентрация которого в среде определяет скорость ро­ста. Другие компоненты могут присутствовать в коли­чествах либо превышающих потребности клеток, либо субоптимальных, т. е. ниже такого значения, при кото­ром один из компонентов становится фактором, почти ограничивающим рост. В хемостате в режиме установив­шегося состояния таким фактором является скорость разведения, которая регулирует концентрацию лимити­рующего рост питательного вещества в среде, окружаю­щей клетки. Таким образом, в хемостате численное зна­чение удельной скорости роста определяется двумя вели­чинами, не зависящими от общего количества клеток в сосуде для культивирования. Однако в некоторых ситуа­циях это положение справедливо и для циклически пи­таемых культур.

Предложены уравнения, устанавливающие связь между скоростью потока раствора питательных веществ и удельной скоростью роста микробов в циклически пи­таемой культуре [125]. Эти уравнения иллюстрируют основные свойства такого типа культивирования и де­монстрируют возможные пути и условия проведения ана­логии между ним и непрерывным культивированием. Различают три основных типа циклически питаемых куль­тур: 1) культура, в которой удельная скорость роста микробов не меняется со временем; 2) культура, в ко­торой скорость потока питательных веществ является функцией времени; 3) культура, в которой скорость по­тока питательных веществ постоянна.

В практических условиях возможны многочисленные вариации в режиме работы циклически питаемых куль­тур. Например, непрерывная или периодическая подача питательных веществ: после определенного периода вре­мени могут быть удалены либо клетки, либо использо­ванная среда, а затем процесс выращивания можно по- 170

вторить или расширить. В работе [125] рассмотрены только непрерывно питаемые системы, при культивиро­вании которых удаление клеток или жидкостей до окон­чания периода роста не производится. Выведенные урав­нения соответствуют идеализированному состоянию мик­робного роста, во время которого выход клеток, рассчи­танный по одному лимитирующему рост питательному веществу, остается постоянным. Поэтому предполагают, что все клетки находятся в состоянии сбалансированно­го роста, репликация клеток носит асинхронный харак­тер, клеточный метаболизм не зависит непосредственно от возраста культуры и влиянием условий для поддер­жания роста можно пренебречь. Полагают, что увеличе­ние объема среды в культуральном сосуде равно объе­му подаваемого питательного раствора.

Постоянная удельная скорость роста. Из уравнения экспоненциального роста микроорганиз­мов следует, что

Хд=Х„[ехр(рт) —11, (176)

где Хд—количество клеток в момент времени т=^0; Хо — то же в момент времени т=0; р— коэффициент скорости роста; т — время.

Кроме того,

= (¹⁷⁷⁾ где Vf — объем подаваемого в культуральный сосуд питательного раствора; — концентрация подаваемого лимитирующего рост пи­тательного вещества; У^ — коэффициент выхода.

Комбинируя уравнения [176] и [177], получают;

V/=-Др--— [ехр (рт) — 1] (178)

у у

или

У_/ = К_и[ехр(рт)-1], (179)

где значение Ку, которое называют «константой объема», представ­ляет собой результирующий фактор, равный количеству клеток в момент времени т=0, деленному на произведение коэффициента вы­хода и концентрации лимитирующего рост питательного вещества в подаваемой среде.

Зависимость между скоростью потока питательного вещества и удельной скоростью роста получают путем дифференцирования по времени:

Постоянная скорость изменения пото­ка.

где F_o — скорость потока лимитирующего рост питательного веще­ства при подаче в нулевое время; g— скорость изменения величи­ны потока во времени.

Отсюда

Допуская, что подача питания является единственным фактором, влияющим на объем жидкости в культураль­ном сосуде, получаем:

Следовательно,

Постоянная скорость подачи питания. Когда скорость подачи питания поддерживается посто­янной, значение g равно нулю и уравнение (191) приво­дится к следующему виду:

При т = 0 уравнения (191) и (194) становятся иден­тичными:

Аналогичным образом, приравнивая значение g к ну­лю, из уравнения (188) можно получить выражения для А и К.

Сравнение уравнений (176) и (178) показывает, что в случае циклически питаемого процесса с постоянной скоростью роста при определенных условиях концентра­ция клеток может поддерживаться постоянной. Это ус­ловие ограничивается тем, что константа объема Kv должна быть равна по величине объему жидкости в со­суде в нулевое время. То, что аналогичная ситуация име­ет место при процессах, в которых скорость роста варь­ирует в зависимости от времени, подтверждается при сравнении уравнений (187) и (193).

Когда величина Kv равна К_о и скорость подачи пи­тания постоянна, удельная скорость роста клеток в ци­клически питаемых культурах должна быть равна F/V—скорости разведения в сосуде для культивирова­ния.

тим, что предварительным условием для проведения лю­бой достаточно близкой аналогии между циклически и постоянно питаемыми культурами должно быть равенст­во значений Kv и Vo- Однако процесс культивирования с циклической подачей питания необязательно проводить таким путем. Например, Kv может быть меньше значе­ния Vo. Это возможно при подаче концентрированных питательных сред со сравнительно низкой скоростью в относительно большой объем содержимого в сосуде.

В табл. 37 приведены суммарные данные временной зависимости трех факторов, касающихся размножения

Таблица 37. Некоторые характеристики циклически питаемых процессов

клеток: удельной скорости роста р; скорости продуци­рования клеток dXjdx и концентрации клеток X. Очевид­но, что три основных типа циклически питаемого процес­са: с повышающейся (экспоненциальной) скоростью по­дачи питательных веществ, с повышающейся (линейной) скоростью подачи питательных веществ и с постоянной скоростью подачи — обладают определенными свойства­ми. При процессе 1-го типа постоянна удельная скорость роста, а при процессе 3-го типа постоянна скорость про­дуцирования клеток. Исходя из равенства или неравен­ства K_v и Уо, можно судить, является ли концентрация клеток постоянной или нет при любом из трех типов процесса.

Для циклически питаемых процессов указанного вы­ше типа характерны две особенности: 1) количество био­массы в ферментерах возрастает со временем; 2) по­стоянные удельная скорость микробного роста и проду-

цирование клеток являются взаимоисключающими.

Показано, что скорость роста и концентрация пода­ваемого субстрата влияют на качество продукта, выхо­дящего из хемостатов, которые содержат бактерии в чи­стой и смешанной культуре [115]. Таким образом, наме­тилось еще одно направление активного влияния на качество продукта с помощью непрерывного поддержа­ния требуемой концентрации субстрата в культуральной жидкости. Решение этой задачи невозможно без исполь­зования дозирующих устройств.

При направленном биосинтезе одним из наиболее эф­фективных способов регулирования процесса является введение предшественников (процессы получения пени­циллина и витамина В12) [6]. Доказана целесообраз­ность введения предшественников в среду для фермента­ции новобиоцина. Исключительно важным является тот факт, что условия накопления антибиотика могут ко­ренным образом отличаться от условий культивирования, при которых происходит накопление биомассы. Это предъявляет повышенные требования к процессам до­зирования жидкостей, обеспечивающих регулирование процесса на обоих этапах.

9.2.