NO-синтаза
NO-радикалы являются эндотелиальным фактором релаксации сосудов и могут участвовать в окислении ЛНП. Эксперименты in vitro показали, что одновременное образование в бесклеточной среде O2 и NO· в результате распада морфолиносидноними- на (SIN-1) индуцировало окисление ЛНП, что проявлялось в накоплении продуктов
ПОЛ [514, 516] и окислении α-токоферола [770].
SIN-1 в концентрации 1 мг/мл как сам по себе индуцировал образование ТБК-РП в ЛНП, так и усиливал их появление в присутствии 5 мкМ ионов меди [1005]. В этих условиях СОД ингибировала окисление, каталаза и маннитол не оказывали эффекта, ингибитор пероксильных радикалов ионол снижал накопление продуктов ПОЛ [516]. В то же время обнаружено, что по отдельности ни О2, ни NO· не обладают подобным эффектом [823]; при инкубации ЛНП с SIN-1 в них хотя и наблюдалось увеличение содержания гидроперекисей и истощение антиоксидантов, тем не менее не изменялись ни электрофоретическая подвижность ЛНП, ни их поглощение макрофагами. Аналогичные изменения с образованием «минимально окисленных» ЛНП наблюдались при действии нитрита (NO2), который образуется в реакции NO· с кислородом [440].Доноры NO· ^-нитрозо-^ацетилпеницилламин и нитропруссид натрия), которые образуют только NO·, так же как и раствор NO· в деоксигенированном буфере, дозозависимо ингибировали Си2+-индуцированное окисление ЛНП и захват модифицированных ЛНП макрофагами [771, 1005], что позволяет рассматривать NO· как анти- атерогенное соединение, ингибирующее липидные радикалы. Окисление ЛНП, индуцированное липоксигеназой из соевых бобов, снижалось при прокачивании через среду газообразного NO· или добавлением доноров NO· [1434], при этом было показано, что NO· действует не как ингибитор фермента, а как перехватчик радикалов LO· и LO2. Действительно, константа взаимодействия NO-радикалов с перекисными радикалами ненасыщенных жирных кислот может достигать значений 109 М-1с-1, что на два порядка выше скорости ингибирования перекисных радикалов α-токоферолом [517].
Добавление в среду инкубации генерирующих NO· соединений приводило к ингибированию окисления ЛНП макрофагами [1809] и эндотелиоцитами [1084]. Моделирование ситуации одновременного клеточного синтеза О2 и NO· (стимуляция фор- болмиристатацетатом макрофагов, примированных интерфероном-γ) не изменяло окислительной модификации ЛНП, а селективная индукция синтеза NO· снижала ее в 2—3 раза (эффект отменялся ингибитором NO-синтазы) [823]. Вместе с тем ингибиторы NO-синтазы не влияли на окисление ЛНП резидентными макрофагами мыши [1759]. Таким образом, эксперименты in vitro не дают однозначного ответа на вопрос о роли NO-радикалов в окислительной модификации ЛНП: данные радикалы могут как индуцировать, так и ингибировать окисление. Такое неоднозначное действие NO· определяется состоянием среды, и прежде всего — наличием в среде супероксидного аниона.
Взаимодействие оксида азота с супероксид-анионом приводит к образованию сильного окислителя — пероксинитрита (ONOO-). Пероксинитрит может модифицировать ЛНП, делая их доступными для захвата макрофагами через скэвинджер-рецеп- торы, при этом в липопротеинах наблюдался переход α-токоферола в хинонную форму [679]. Взаимодействие ONOO- с тирозиновыми остатками белков приводит к образованию 3-нитротирозина. Содержание нитротирозиновых остатков в плазме здоровых людей составляет 12 ± 0,01 мкМ, в выделенных ЛНП 0,03 ± 0,006 нмоль/мг белка, их концентрация возрастает при воспалительных процессах или обработке плазмы пе- роксинитритом [884]; с помощью моноклональных антител повышенное содержание нитротирозиновых остатков в белках выявлено в атеросклеротических бляшках артерий человека [315]; сравнение нативных сывороточных ЛНП и выделенных из стенок атеросклеротически пораженных сосудов ЛНП показало, что в липопротеинах из атеросклеротических сосудов содержание 3-нитротирозина в 90 раз выше [995]. Это указывает на возможность участия пероксинитрита в окислительной модификации ЛНП, и прежде всего — в области атеросклеротических бляшек.
В организме in vivo действие пероксинитрита может быть направлено не только на окислительную модификацию ЛНП, но и на снижение антиоксидантной активности плазмы крови. Так, прямое воздействие ONOO- на плазму крови человека приводило к быстрому окислению аскорбиновой кислоты, мочевой кислоты и SН-групп в белках; несмотря на то, что уровень α-токоферола изменялся незначительно, общая антиокислительная активность снижалась и повышалось содержание гидроперекисей [1679]. Кроме того, пероксинитрит индуцирует выход ионов меди из церулоплазмина, которые в свою очередь индуцируют окисление в реакции Фентона [1589]. Так как NO· эффективно ингибирует кислородные радикалы и одновременно ответственен за образование пероксинитрита, способного индуцировать свободнорадикальное окисление, то многие исследователи считают, что вклад NO-радикалов в окислительную модификацию ЛНП может быть двояким: при оптимальном для образования пероксинитрита соотношении генерации радикалов NO· и О2, близком к единице, окисление ЛНП индуцируется, а если в среде преимущественно образуется NO· — окисление ингибируется [517, 1005].
Многочисленными исследованиями было установлено, что атеросклеротическое поражение сосудов у людей и экспериментальных животных связано с нарушением сократительной функции артерий, снижением эндотелиальной продукции NO· [996, 1682] или, возможно, ингибированием его биологической активности [1187]. На начальной стадии атерогенеза, вызванного гиперхолестеринемией, у животных наблюдается повышение активности эндотелиальной NO-синтазы, что связывается с антиатерогенным ответом организма. Индукторами эндотелиального фермента могут выступать окисленные ЛНП, возможно гидроперекиси жирных кислот, в частности, линолевой кислоты [1374]. У кроликов, находящихся на гиперхолестериновой диете, выявлена индукция индуцибельной NO-синтазы в гладкомышечных клетках аорты [1153, 1687]. В организме продуцентами NO· могут выступать пенистые клетки макрофагального происхождения, при этом необходимо отметить, что окисленные ЛНП оказывают ингибирующий эффект на индуцибельную NO-синтазу [1802].
Женский гормон 17β-эстрадиол усиливает продукцию NO· эндотелиоцитами, в результате у самок млекопитающих спонтанная продукция оксида азота значительно выше и они менее подвержены атеросклерозу [1193].Помимо регуляции тонуса сосудов NO· обладает очень широким спектром биологического действия, поэтому хотя нет прямых доказательств участия NO-синтаз эндо- телиоцитов, моноцитов, макрофагов, гладкомышечных клеток в окислении ЛНП, все же участие этих ферментов в атерогенезе не вызывает сомнений [1749]. Так, окисленные, но не нативные, ЛНП прямо ингибируют NO· [455], в результате чего повышается адгезия нейтрофилов к эндотелию и усиливается их деструктивное действие на стенку сосуда [996]. NO· снижает синтез эндотелиоцитами макрофагального колониестимулирующего фактора [1303], а также подавляет пролиферацию [1193] и миграцию [1460] гладкомышечных клеток, что тормозит развитие атеросклеротической бляшки. Высокие, атерогенные концентрации ЛНП (180 и 240 мг холестерина/л) после 48-часовой инкубации с эндотелиоцитами ингибировали в клетках NO-синтазу, что может лежать в основе высокого уровня атеросклероза у людей с гиперхолестеринемией [1693]. Введение в рацион питания гиперхолестериновых животных L-аргинина (предшественник NO·) предотвращало у них атеросклеротическое поражение сосудов [484], более того, у них наблюдалась регрессия атеросклеротических бляшек в результате индукции клеточного апоптоза [1714].
В ряде исследований установлено, что полиморфизмы гена, кодирующего эндотелиальную NO-синтазу, и его промотора ассоциированы с атеросклеротическим поражением сосудов человека [1070]. Так, полиморфизм G894T, приводящий к замене остатка глутамина на аспарагин в положении 298 и уменьшению стабильности молекулы фермента, связан с коронароспазмом [1828] и повышением риска развития ишемической болезни сердца [415]; генотип СС при полиморфизме T-786C в промоторном участке гена эндотелиальной NO-синтазы чаще встречается у больных ишемической болезнью сердца, чем у здоровых людей [418]. Увеличение числа СА-повторов интрона 13, сопровождающееся изменением экспрессии фермента на уровне сплайсинга мРНК, также является фактором риска возникновения атеросклеротического поражения коронарных артерий [1556].