Липоксигеназы
Липоксигеназы (КФ 1.13.11.12) катализируют окисление полиненасыщенных жирных кислот с образованием гидропероксидов:
Свободные неэтерифицированные жирные кислоты являются предпочтительным субстратом для окисления [117].
В клетках животных липоксигеназы отвечают за синтез лейкотриенов, образующихся при окислении арахидоновой кислоты, и в зависимости от положения двойной связи и атома углерода, по которому идет окисление, они разделяются на 5-, 8-, 12- и 15-липоксигеназы:
В 1988 г. впервые было показано, что инкубация ЛНП с липоксигеназой-1 соевых бобов и фосфолипазой А приводит к окислению липопротеинов [1546]. Исследования разных липоксигеназ показали, что 15-липоксигеназа (цифрой обозначается место двойной связи, по которой идет окисление жирной кислоты; в данном случае она находится у 15-го углеродного атома) кролика и человека и 12-липоксигеназа из лейкоцитов свиньи эффективно окисляют ЛНП in vitro; а 12-липоксигеназа из человеческих тромбоцитов, рекомбинантная 5-липоксигеназа человеческих лейкоцитов и липоксигеназа-1 из соевых бобов менее эффективны в окислении ЛНП [941]. Было также показано, что продукты липоксигеназной реакции усиливали Cu-индуцированное окисление ЛНП [641]. Ингибирование липоксигеназ в перитонеальных макрофагах мыши [1378, 1759], эндотелиальных клетках аорты кролика [1292], стимулированных зимозаном или липополисахаридом моноцитах из крови человека [1133] приводит к снижению клеточного окисления ЛНП. В то же время ингибиторы циклооксигеназы не влияли на данный процесс (табл. 7).
Высокая активность 15-липоксигеназы была выявлена в атеросклеротических бляшках аорты кролика и богатых макрофагами участках атеросклеротически пораженных артерий человека [1820], при этом методом молекулярной гибридизации была показана экспрессия матричной РНК фермента в бляшках аорты как кролика [1819], так и человека [1820].
В экспериментальных исследованиях показано, что повышение активности 15-липоксигеназы в образцах стенок артерий выявляется уже через 3 недели после перевода кроликов на богатую холестерином (1 % холестерина) диету [757]. Хотя механизмы изменения активности фермента неясны, было показано, что рецепторное связывание ЛНП с эндотелием приводит к активации липоксигеназ [538]. Внедрение с помощью ретровируса гена 15-липоксигеназы в клетки артерий кролика позволило в 3 раза повысить активность данного фермента в образцах подвздошной артерии (наблюдение в течение 3 недель); при этом не наблюдалось повышения окисления ЛНП по сравнению с контрольными животными [1817]. Однако если животные с пересажен- 1 61 гТаблица 7
Влияние ингибиторов цикло- и липоксигеназ на клеточное окисление ЛНП
| Ингибитор | Эндотелиоциты кролика [1290] | Моноциты человека [1133] | ||
| Концентрация ингибитора | Эффект | Концентрация ингибитора | Эффект | |
| Индометацин | 50 мкМ | Отсутствие влияния | 30 мкМ | Отсутствие влияния |
| Ацетилсалициловая | 1 мМ | Отсутствие | 30 мкМ | Отсутствие |
| кислота | влияния | влияния | ||
| Ибупрофен | Нет данных | Нет данных | 30 мкМ | Отсутствие влияния |
| Нордигидрогваяретовая кислота | 0,5 мкМ | Снижение окисления | 10 мкМ | Снижение окисления |
| 5,8,11,14-Эйкоза- тетраеновая кислота | 20 мкМ | Снижение окисления | 50 мкМ | Снижение окисления |
Примечание. Окислительную модификацию ЛНП определяли по накоплению ТБК-РП, а также по скорости деградации ЛНП макрофагами [1133] и цитотоксичности против фибробластов в культуре [1290].
ным геном и повышенной активностью 15-липоксигеназы содержались на рационе с 0,13 % холестерина, то в их артериях через 2 недели увеличивалось содержание характерных для окисленных ЛНП белково-липидных аддуктов, которые не обнаруживались у контрольных животных.
5- Липоксигеназа также выявляется в атеросклеротических бляшках, преимущественно в CD68+ макрофагах и дендритных клетках [1370]. Эксперименты на животных, нокаутированных по гену 5-липоксигеназы, показывают участие данного фермента в формировании атеросклеротических бляшек. Так, у дефицитных по рецептору к ЛНП мышей, содержащихся на атерогенной диете, выключение гена 5-липоксигеназы оказывает существенное защитное действие: площадь атеросклеротического поражения аорты у мышей с генотипом 5-LO+/+/LDLR/- в 26 раз превышала таковую у двойных нокаутов, у гетерозиготных по 5-липоксигеназе 5-LO+/-/LDLR-/- площадь также снижена, хотя по содержанию холестерина в крови животные не различались [1134]. Таким образом, имеется достаточное количество данных, указывающих на возможность участия липоксиге- наз в окислительной модификации ЛНП и атерогенезе in vivo.
Существует предположение, что действие липоксигеназ на ЛНП может быть опосредовано через образование O2 [942]. Однако в таком случае непонятно, почему ингибиторы циклооксигеназы, которая также дает начало образованию супероксид-аниона [147], не влияют на окисление ЛНП (см. табл. 7). Возникающее противоречие можно объяснить тем, что при окислении арахидоната по липоксигеназному пути, в отличие от циклооксигеназного, образуется ОН-радикал [147], который, очевидно и опосредует окислительную модификацию ЛНП. Кроме того, возможно непрямое действие липоксигеназ на ЛНП через продукцию органических перекисей, которые могут инкорпорироваться в ЛНП и подвергаться расщеплению с образованием реакционных гидрокси- и пероксирадикалов [1292]. В пользу данного положения свидетельствует тот факт, что инкубация макрофагов с 50 мкМ FeSO4 в течение 4 часов приводит к 2—4-кратному повышению содержание в них МДА, диеновых конъюгатов и органических перекисей.
Способность таких макрофагов окислять ЛНП возрастает в 8 раз [626], что указывает на возможность инкорпорации продуктов радикального окисления в липопротеины. Аналогичное «примирование» ЛНП к последующему ион-индуцированному окислению наблюдается при инкубации с продуктами липоксигеназного окисления жирных кислот [1241]. Так как субстратом для липоксигеназ являются ненасыщенные жирные кислоты, высвобождающиеся из мембран в результате действия фосфолипазы A2, то ее ингибирование снижает окислительную модификацию ЛНП эндотелиоцитами [1291].Вопрос об участии липоксигеназ в клеточном окислении ЛНП оказался не столь простым. Хотя подавление активности ферментов снижает клеточное окисление ЛНП, анализ концентрационной эффективности и специфичности применяемых ферментативных ингибиторов свидетельствует об их скорее антиоксидантном или цитотоксическом, нежели антилипоксигеназном действии [1545, 1759]. Кроме того, эндотелиоциты с пониженной активностью липоксигеназ окисляли ЛНП так же эффективно, как нормальные клетки. Поэтому некоторые исследователи считают, что ни 5-, ни 15-липок- сигеназы не играют существенной роли в клеточном окислении ЛНП [613, 822, 1545]. Вместе с тем предполагается, что участие 15-липоксигеназы в атерогенезе может реализоваться через продукты реакции, в частности метаболиты линолевой кислоты, которые модулируют экспрессию генов и усиливают клеточную пролиферацию [597].