Определение сроков выживаемости цист патогенных кишечных простейших в различных условиях окружающей среды
Сведения о жизнеспособности цист патогенных кишечных простейших в окружающей среде необходимы при изучении санитар- но-протозоологической и эпидемиологической ситуации и оценке эффективности проводимых профилактических мероприятий в очагах кишечных протозойных инвазий.
Для постановки опытов целесообразно использовать цисты лямблий, которые при наличии одинаковых микроклиматических условии в окружающей среде не отличаются, согласно нашим данным, по своей устойчивости от цист дизентерийных амеб. Следует учитывать и то, что частота обнаружения лямблий у населения более значительна по сравнению с таковой дизентерийных амеб. При лямблиозе также в 3,2 раза выше интенсивность цистовыделения, что имеет важное практическое значение при накоплении цист для постановки опытов.Почва. Необходимые для экспериментальных исследований цисты лямблий выделяют из содержимого кишечника инвазированных людей методом механического обогащения. Из полученной взвеси цист готовят опытные тест-объекты. C этой целью наносят пастеровской пипеткой на мембранные фильтры № 4 или № 6 0,2 мл указанной взвеси, в которой содержится свыше 4—5 тыс. жизнеспособных цист. Фильтры складывают по типу конверта и помещают в капроновые мешочки размером 3x2,5 см, которые вкладывают в среднюЮ, нижнюю и верхнюю части перфорированных алюминиевых трубок длиной 10 см, диаметром 2X2,5 см, содержащих почву с подопытных участков. Трубки с пробами цист кишечных простейших размещают на расстоянии 8—10 см друг от друга в алюминиевой сетке сечением 30x50 см и высотой 7—10 см, которая предварительно заполняется почвой с подопытного участка. Сетку закапывают в почву на этом участке на такую глубину, чтобы верхний конец алюминиевых трубок находился на уровне поверхности почвы. Сетку засыпают сверху тонким слоем почвы подопытного участка.
Трубки с пробами цист кишечных простейших вынимают из почвы участка и доставляют в лабораторию для исследования 1 раз в неделю.
Извлеченные из трубок капроновые мешочки ополаскивают водой. Жизнеспособные и погибшие цисты кишечных простейших, содержащиеся в мембранных фильтрах, могут быть идентифицированы в исследуемом материале под люминесцентным микроскопом при помощи акридинового оранжевого. C этой целью на предметное стекло наносят каплю 0,1—0,2 % водного раствора акридинового оранжевого и делают отпечаток с развернутого фильтра, извлеченного из капронового мешочка. При этом тщательно смывают красителем с фильтра нанесенную взвесь цист. Полученную на предметном стекле смесь накрывают покровным стеклом и спустя 30—45 мин исследуют под люминесцентным микроскопом.У живых цист при этом наблюдается лишь слегка окрашенная в оранжевый цвет оболочка, а цитоплазма имеет темноватый оттенок. Цитоплазма и оболочка у погибших цист окрашиваются в красный или красно-кирпичный цвет.
При отсутствии в лаборатории люминесцентного микроскопа идентификацию жизнеспособных и нежизнеспособных цист кишечных простейших можно осуществить под световым микроскопом B препаратах, окрашенных акридиновым оранжевым. Препараты готовят в этом случае по той же методике, что и при люминесцентной микроскопии. Под световым микроскопом жизнеспособные цисты кишечных простейших остаются неокрашенными, а мертвые приобретают желтую окраску.
При оценке жизнеспособности цистных форм простейших мы учитывали то, что любой повреждающий агент вызывает изменения в живой клетке, основу которых составляет денатурация клеточных белков. Наиболее доступным для наблюдения признаком повреждения живой клетки является изменение ее сорбционных свойств, которые могут быть обнаружены при помощи метода витального окрашивания. Идентификация жизнеспособных и нежизнеспособных цист кишечных простейших основана на разной проницаемости оболочки живых и погибших клеток для витальных красителей и флюорохромов и повышенной адсорбции красителей белками по- врежденной и отмирающей цитоплазмы.
Для определения соотношения между жизнеспособными и нежизнеспособными цистами достаточно подсчитать их число в 3—5 рядах покровного стекла.
Число жизнеспособных и погибших цист, содержащихся в исследуемой пробе, определяют по предложенной нами формуле:M = A X B X C хД,
где M — число живых или погибших цист соответствующего вида кишечных простейших, содержащихся в пробе; A — число цист, обнаруженных в 1 ряду под покровным стеклом; B — число рядов покровного стекла, которое было использовано для подсчета цист; C — число капель в 1 мл смыва; Д — объем смыва с мембранного фильтра (мл).
O динамике отмирания цист судят по изменению количественного соотношения между жизнеспособными и погибшими цистами.
Молочные продукты. Накопление цист кишечных простейших и приготовление испытуемых тест-объектов осуществляют по той же методике, что и при определении сроков их выживаемости в почве. Затем приготовленные в мембранных фильтрах пакетики, внесенные в капроновые мешочки, опускают в стеклянные сосуды, содержащие 100—150 мл молока, кефира, сметаны. Замену молочных продуктов производят 1 раз в 2 сут. Результаты исследования целесообразно учитывать при комнатной температуре (18—22 0C) 1 раз в 3 сут и в условиях бытового холодильника (2—4 °С) — 1 раз в 7—14 сут. Для учета результатов опыта мешочки извлекают из молочных продуктов, промывают их водопроводной водой, а в дальнейшем исследуют по той же методике, что и при изучении выживаемости цист кишечных простейших в почве.
Сточные воды. Первый этап приготовления тест-объектов в мембранных фильтрах, вложенных в капроновые мешочки, остается таким же, как и при определении сроков выживаемости цист кишечных простейших в почве. Затем мешочки перевязывают сверху нитками и погружают в пробирки высотой 10—15 см, диаметром 2 см. B пробирки наливают изотонический раствор натрия хлорида для предупреждения гибели цист до момента погружения пробирок в сточную воду. Для того чтобы предупредить всплывание в пробирке мешочков с пакетиками исследуемого материала, в мешочки вкладывают кусочки гранита величиной с фасоль. Пробирки с исследуемым материалом помещают в перфорированные жестяные банки, к которым прикрепляется тонкая медная проволока.
Перед погружением банок в исследуемую сточную воду на разных этапах очистных сооружений изотонический раствор натрия хлорида из пробирок удаляют. Банки с пробками фиксируют при помощи проволоки в условиях опытной канализационной установки. Пробы для изучения сроков выживаемости цист извлекают из очистного сооружения 1 раз в неделю и исследуют в дальнейшем по той же методике, что и почву.Поверхность твердых материалов. Необходимость изучения сроков выживаемости цист кишечных простейших на поверхности различных материалов обусловлена тем, что указанные материалы применяются в пищевой промышленности и в быту в качестве упаковки пищевых продуктов. Обогащенную взвесь цист кишечных простейших объемом 0,2 мл наносят тонким слоем на поверхность опытных образцов, которые помещают в емкости, позволяющие активно регулировать температуру и относительную влажность воздуха. B качестве таких емкостей можно использовать термостат и холодильник, необходимая температура в которых устанавливается при помощи терморегуляторов. Обеспечение необходимой относительной влажности воздухадостигается путем помещения в указанные емкости соответствующего количества чашек Петри с дистиллированной водой, в которой увлажняются полоски из марли. Выживаемость цист целесообразно изучать при температуре 2—6 и 18—27 0C и относительной влажности воздуха 40—65 и 80—100 %. Определение температуры и относительной влажности воздуха производят при помощи термовлагобарометра БМ-2.
Жизнеспособность цист определяют при помощи методов витального окрашивания и люминесцентной микроскопии.
Для того чтобы установить предельные сроки выживаемости и интенсивность гибели цист кишечных простейших на поверхности опытных образцов, изготовленных из стекла, на изучаемую взвесь цист наносят через определенные промежутки времени 1 каплю 0,1 % водного раствора эозина или 1 каплю 0,1—0,2 % водного раствора акридинового оранжевого, тщательно растирают в ней исследуемую взвесь, накрывают покровным стеклом и просматривают приготовленные препараты соответственно при помощи светового или люминесцентного микроскопа. При изучении выживаемости цист кишечных простейших на опытных образцах, изготовленных из светонепроницаемых материалов (металлы, дерево, полимеры, картон и др.), исследуемая взвесь цист вначале тщательно смешивается на поверхности опытного образца с водным раствором соответствующего красителя, затем каплю этой взвеси переносят на предметное стекло, накрывают ее покровным стеклом и анализируют под световым или люминесцентным микроскопом. B препаратах, окрашенных раствором эозина, жизнеспособные цисты кишечных простейших остаются неокрашенными, а мертвые приобретают розовую окраску. Характер окраски живых и погибших цист при применении акридинового оранжевого под световым и люминесцентным микроскопом такой же, как и при определении их жизнеспособности в почве.