Исследование почвы на яйца гельминтов

При выборе объектов для данного исследования необходимо учитывать их роль как возможных факторов передачи возбудителей инвазии (возможность обсеменения инвазионным материалом, а также контакта с человеком).

Отбор проб почвы. При изучении степени загрязнения почвы яйцами гельминтов пробы ее отбирают в соответствии с ГОСТом 5*

17-4.4-02—84 «Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического и протозоологического исследования». Их берут с поверхности (1—3 см) — во дворах; с поверхности и с глубины 10—20 см — на огородах, в садах, на полях орошения.

C поверхности (1—3 см) пробы почвы берут ложкой, совочком или большим шпателем, а с глубины 10—20 см — лопатой или буром Некрасова. Пробы помещают в банки с крышками или пакеты из клеенки, целлофана. Каждая проба должна иметь этикетку с указанием места забора, даты, глубины, характера исследуемого участка (в тени или на солнце, состав почвы, наличие растительности и т.п.).

Для выяснения обсеменения яйцами гельминтов исследуемой территории на участках вблизи выгребов, мусорных ящиков и подобных мест выделяют площадку в 25 м2. Другую площадку такого же размера берут вдали от указанных объектов. C каждой из этих площадок по диагонали отбирают 5—10 навесок по 10—20 г. После тщательного перемешивания этих навесок составляют среднюю пробу (масса каждой не менее 100—200 г).

B лаборатории пробы помещают (в пакетах) в холодильник или каждую из них пересыпают в кристаллизатор, заливают 3 % раствором формалина на физиологическом растворе (жидкость Барбагал- ло) или 3 % раствором соляной кислоты, а затем ставят в холодильник.

Методика исследования. Для исследования почвы на яйца гельминтов предложены следующие методы.

Метод З.Г.Васильковой и В.А.Гефтер (1948) заключается в том, что 5—I0 г почвы тщательно смешивают с 5 % раствором едкого натра (или калия) в центрифужных пробирках объемом 50 см3, смесь центрифугируют в течение 1—2 мин, после чего избыток едкого натрия (или калия) сливают, осадок тщательно смешивают с насыщенным раствором нитрата натрия (плотность 1,39) и центрифугируют в течение 2 мин не менее 5 раз. После каждого центрифугирования поверхностную пленку переносят петлей в стаканчик с водой; смесь вновь тщательно перемешивают и центрифугируют. Снятую поверхностную пленку фильтруют в аппарате Гольдмана с использованием планктонных фильтров, которые затем микроскопируют. По данным авторов, эффективность метода достигает 44,6 %. Было предложено вместо снятия поверхностной пленки из центрифужных пробирок сливать часть насыщенного раствора соли в стаканчик с водой, а в пробирки с осадком добавлять столько же чистого раствора соли. Такую процедуру следует повторять не менее 3—5 раз. Последний раз сливается весь раствор соли, который фильтруют в аппарате Гольдмана, используя фильтры № 6, затем проводят микроскопию последних. Благодаря такому усовершенствованию автору удалось повысить эффективность выявления яиц гельминтов из почвы до 60—69,2 %.

В.А.Лугина (1968) рекомендовал вначале обрабатывать почву по методу З.Г.Васильковой и В.А.Гефтер, а затем, удалив щелочь, к осадку добавлять насыщенный раствор нитрата аммония. После перемешивания и центрифугирования смеси сливают насыщенный раствор в стаканчик высотой 3 см, последний накрывают счетной пластинкой и весь раствор микроскопируют. Это исключает использование аппарата Гольдмана, насоса Камовского, фильтры. Недостатки: трудность просмотра раствора соли, многократные переливы последнего снижают эффективность выявления яиц гельминтов на 20—30 %.

Н.А.Романенко (1968) и Г.Ш.Гуджабидзе (1969) предложили помещать 25 г почвы в центрифужные пробирки объемом 250 мл (в случае отсутствия пробирок такого объема можно пользоваться пробирками объемом 80—100 мл, но помещать в них следует 15 г почвы) и заливать ее 3 % раствором натриевой или калиевой щелочи (в соотношении 1:1). После этого содержимое пробирок тщательно размешивают при помощи электромешалки или стеклянных палочек, отстаивают в течение 20—30 мин, а затем центрифугируют 5 мин при 800 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а почву промывают водой (1—5 раз в зависимости от типа почвы: для песчаных и супесчаных — достаточно одной промывки, для глинистых, суглинистых, черноземных — от 2 до 5) до получения прозрачной надосадочной жидкости. После промывки к почве добавляют 150 мл (45 мл в пробирки объемом 100 мл) насыщенного (плотность 1,38— 1,4) раствора нитрата натрия, тщательно размешивают и центрифугируют. Пробирки устанавливают в штатив, доливают тем же раствором соли до уровня на 2—3 мм ниже краев пробирок и накрывают предметными стеклами. При этом очень важно исключить какую-либо потерю поверхностной пленки. Для этого между краем пробирки и предметным стеклом следует оставлять пространство шириной не более 10 мм, куда с помощью пипетки вносят насыщенный раствор соли до его соприкосновения с нижней поверхностью стекла. После этого предметные стекла осторожно передвигают до полного покрытия центрифужных пробирок. Через 20—25 мин отстоя стекла снимают, переворачивая нижней поверхностью вверх, а на их место ставят другие, при необходимости и третьи. Ha снятые стекла наносят несколько капель 50 % раствора глицерина. Капли накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Для обнаружения яиц гельминтов предметные стекла просматривают при увеличении в 80 раз (окуляр 10x, объектив 8X0,2), а для определения степени их развития или деформации — в 400 раз (окуляр 10x, объек- тив 40Х0,65). Эффективность метода 59,6—83,1 %, в среднем 73 %; на нее оказывают влияние тип и механический состав почвы, содержание перегноя, илистых фракций, емкость поглощения.

спериментальных исследований рассчитаны поправочные коэффициенты (табл.11) для установления истинного загрязнения некоторых типов почв яйцами гельминтов. Применение поправочных коэффициентов позволяет определять истинное обсеменение почвы яйцами гельминтов. Для других типов почв и яиц гельминтов необходимо провести дополнительные экспериментальные исследования.

T а б л и ц a 11. Поправочные коэффициенты для расчета истинной загрязненности некоторых почв яйцами гельминтов

Ha обработку проб почвы рекомендуемым методом затрачивается 4,6—10 ч (метод З.Г.Васильковой и В.А.Гефтер в модификации А.А.Намитокова требует 9—51,5 ч, т.е.

Необходимо помнить, что в очагах описторхоза, клонорхоза данная методика малопригодна, ибо яйца этих гельминтов, имеющие плотность больше таковой насыщенного раствора нитрата натрия, не будут всплывать в поверхностную пленку, а, наоборот, выпадут в осадок.

B таких случаях целесообразно применять флотационные растворы высокой плотности. Некоторые авторы предлагают для исследования почвы и донных отложений на яйца гельминтов методику с использованием малогабаритной клинической центрифуги ОПН-3.

Пробы донных отложений поверхностных водоемов отбирают B соответствии с ГОСТом 17.1.5.01.—80«Охрана природы. Гидросфера. Общие требования к отбору донных отложений водных объектов для анализа на загрязненность». Для отбора проб применяют различные системы пробоотборников: дночерпатели, драги, стратй- метры и трубки различных конструкций. Отбор проб донных отложений ручным или механизированным способом проводят с берега или различных плавсредств.

B 26 клинических центрифужных пробирок объемом по 10 мл наливают 6 мл 2—3 % раствора едкого натрия (или калия) и вносят 2—2,5 г почвы или донных отложений (общая масса материала составляет 40—50 г). Содержимое пробирок перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при 1500 об/мин в течение-3 мин. B дальнейшем режим центрИфугирования остается постоянным. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 8 мл воды. Смесь перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, а к осадку добавляют 3 мл раствора натриевой или аммиачной селитры (молярное соотношение 9,4:5, плотность 1,4). Содержимое пробирок вновь тщательно перемешивают. При этом яйца гельминтов из почвы переходят в насыщенный раствор. Пробирки центрифугируют и оставляют в покое на 5 мин, после чего надосадочную жидкость переливают в чистый ряд пробирок (одна в одну) и доливают в каждую из них чистой воды до отметки 10 мл. При этом плотность раствора понижается до 1,05. Пробирки встряхивают и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин. Этот прием позволяет сконцентрировать яйца гельминтов в осадке. Надосадочную жидкость сливают, а осадок из каждых 10 пробирок переносят в 2 пробирки. Таким образом, из 20 пробирок осадок концентрируется в 4. B каждую пробирку к осадку доливают воду и сверху наслаивают 1 мл эфира. Пробирки интенсивно встряхивают в течение 30—40 с, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок переносят пастеровской пипеткой на предметное стекло и накрывают покровными стеклами размером 20X20 мм. B случае если осадка мало, его просматривают весь, если его много — к нему добавляют до 0,5 мл воды и просматривают из всего осадка только 0,1 или 0,2 мл, а полученный результат пересчитывают на весь объем осадка, умножая в первом случае на 5, во втором на 2,5. Результаты просмотра осадка, взятого из каждой пробирки, суммируют.

Для повышения эффективности выявления яиц гельминтов и сокращения затрат времени на микроскопирование при исследовании почвы нами предложена камера для количественного учета яиц гельминтов во флотационной жидкости. Камера — усеченный стеклянный конус с углом наклона стенок 85°, приваренный широкой частью к дну чашки Петри. Диаметр верхней части 2,5 см, нижней 4 см, площадь соответственно 5,3 и 15,2 см2, высота 3,5 см, объем 25,6 см3.

Верхняя часть камеры покрывается счетной пластинкой из плексигласа размером 7x7x0,l см. Ha одной поверхности пластинки нанесены параллельные линии — борозды, окрашенные в красный цвет; расстояние между ними 1,2 мм. Последнее равно диаметру поля зрения микроскопа МБИ-1 при кратности увеличения 10x10. Камеру заполняют поверхностным слоем флотационной жидкости до образования выпуклого мениска, после чего ее покрывают счетной пластинкой так, чтобы разлинованная поверхность была обращена к жидкости. Яйца гельминтов всплывают в течение 3—5 мин. Затем камеру помещают на предметный столик микроскопа и просматривают последовательно по интервалам между линиями. Для максимального выявления яиц гельминтов рекомендуется несколько раз собрать поверхностный слой флотационной жидкости. Камеру обеззараживают кипячением в течение 10 мин, а счетную пластинку опускают на 15—20 ч в 2 % раствор карболовой кислоты.

Эффективность выявления яиц гельминтов с помощью предлагаемой камеры изучена в сравнении с таковой при использовании способа В.А.Лугйны, применяемого при исследовании почвы и бытовых сточных вод с одновременным учетом времени, затрачиваемого на микроскопирование при каждом из сравниваемых способов.

Предлагаемой нами камерой выявляется больше на 15,9 % яиц гельминтов в почве и на 32 % в сточных водах и затрачивается в 4 раза меньше времени на микроскопирование. Большую определя- емость яиц гельминтов и снижение затрат времени на микроскопирование предлагаемой камерой, по-видимому, можно объяснить уменьшением площади микроскопирования в конусе, более полным просмотром поверхностной пленки и исключением повторного микроскопирования полей зрения, а также возможностью просмотра всей толщи флотационной жидкости.

Широкое внедрение в практику паразитологических лабораторий предлагаемой камеры для количественного учета яиц гельминтов во флотационной жидкости значительно повысит качество работы и производительность труда лаборантов.

Приготовление насыщенных растворов. Для приготовления насыщенных растворов можно применять как химически чистую соль, так и техническую селитру, используемую в ветеринарной практике, сельском хозяйстве.

Раствор натрия нитрата@4аБЮ3).Вкастрюлеиливедер- ке смешивают натрия нитрат (или любую другую соль) с водой в соотношении 1:1 (1 кг соли на 1 л воды) и подогревают ее до образования кристаллической пленки на поверхности растврра. Затем раствор охлаждают, измеряют денситометром его плотность (должна быть не ниже 1,38—1,4). При охлаждении насыщенного раствора на дно сосуда должны выпадать кристаллы соли.

Раствор свинца нитрата [РЬ(К03)2].Готовятраствор плотностью 1,5 (обладает высокой флотационной способностью). Берут 650 г вещества на 1 л воды. Соль растворяют в горячей воде в эмалированномведре. Ee кладут в ведро с горячей водой порциями, подогревая содержимое ведра на электроплитке и постоянно перемешивая до полного растворения. Фильтровать раствор необязательно. Раствор свинца нитрата со временем дает осадок. B связи с этим его плотность уже через 24 ч после приготовления несколько падает. Поэтому раствор готовят в день исследования. Если же он приготовлен в большом количестве, то в последующие дни перед исследованием его подогревают, размешивая осадок. Свинца нитрат — соль тяжелого металла, поэтому при работе соблюдают осторожность, избегая попадания вещества исследующему внутрь.

Раствор Брудастова: натриевая селитра 900 г, калиевая селитра 400 г, вода 1000 мл. После подогревания и растворения солей плотность раствора достигает 1,47—1,48, через 24 ч она падает до 1,4—1,42, поэтому его следует готовить перед исследованием.

Раствор аммония нитрата ^H4NO3) — гранулированной или обычной аммиачной селитры плотностью 1,3 — делаюттак же, как и предыдущий, но из расчета 1500 г вещества на 1 л воды.

Раствор цинка сульфата (ZnS0^7H,0)aaoTHOCTbrol,24 готовят из расчета 400 г соли на 1 л воды.

Раствор натрия тиосульфата (натрия гипосульфита, Na,S,03X5 H,0) плотностью 1,4 готовят из расчета 1750 г вещества на 1 л воды, а магния сульфата, или английской соли (MgSO4), плотностью 1,26—1,28 — из расчета 920 г вещества на 1 л воды.

Раствор цинка хлорида ^пС1,)плотностью1,82готовят в эмалированной посуде, растворяя в 1 л горячей воды 2 кг вещества (соль быстро растворяется при помешивании). Остывший раствор не кристаллизуется.

Для исследования берут соскоб — 15—25 г материала с поверхности объекта и применяют те же методические приемы, что и при обработке почвы. Соскобы делают в разных местах пола по двум диагоналям. Расстояние между местами взятия соскобов — не более 5 см. Соскобы, произведенные в одном помещении, соединяют в 1 пробу и перемешивают.

B США для выявления яиц токсокар собак из проб почвы применяют флотационный метод, используя при этом раствор цинка сульфата и насыщенный раствор магния сульфата в смеси с 5 % раствором калия йодата.