Анализ экспрессии генов, кодирующих компонентов транскрипционно- го фактора AP1 в биоптатах кожи из очагов склеродермии.

Выделение РНК из биоптатов проводилось на колонках Qiagen согласно стандартному протоколу RNeasy Mini Kit® для кожи. Чтобы освободить препа- раты РНК от примесей ДНК проводилась их обработка ДНКазой Qiagen.

Далее к фрагменту ткани добавляли 300µl RLT буфера (содержащего β- ME) и проводили немедленную гомогенизацию. К полученному гомогенату до- бавляли 590µl ddH2O и 10µl протеиназы K (10 мг/мл, AppliChem, USA) и пере- мешивали методом пипетирования. Смесь инкубировали 10 мин при 55°С, а за- тем центрифугировали 3 мин при 10000g при комнатной температуре, а супер- натант (около 900µl) переносился в новую пробирку.

К супернатанту добавляли половину объема (около 450µl) этанола 96%. 700µl образца, включая преципитат, переносили на RNeasy mini колонку, встав- ленную в 2-х мл пробирку, и центрифугировали 15 сек на скорости 10000об/ мин. Жидкость из пробирки удалялась, после чего повторяли предыдущий этап.

Колонка промывалась с помощью 350µl Buffer RW1, после чего произво- дилась обрабо тка ферментом ДНКазой. Для этого 10µl исходного раствора DNase I с 70µl Buffer RDD добавляли на поверхность силикагеля и оставляли при комнатной температуре на 15 мин. Колонку промывали 350µl Buffer RW1 и дважды 500 µl Buffer RPE.

РНК элюировали 60µl RNAase-free H2O

Концентрация РНК измерялась с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США), после чего образцы выравнивали по концентра- ции в ddH2O.

Обратная транскрипция проводилась следующим образом. В пробирки для ПЦР объемом 200 мкл вносили: буфер, dNTP, 100 ед. обратной транскриптазы M_MLV (Promega), 20 ед. ингибитора РНК_аз RNasin (Promega), 500 нг oligo(dT) праймеров (ДНК_Синтез) и РНК до конечной концентрации не более 100 нг/мкл, после чего осуществлялось термостатирование смеси один час при 37°С.

Для контроля отсутствия примеси ДНК в образце РНК проводили ПЦР на фрагмент гена JUND (forward primer 5’-AGCTCACAGTTCCTCTACCC-3’, reverse primer 5’-GCTGGTTCTGCTTGTGTAAATC-3’) без обратной транскрип- ции.

С целью контроля выделения РНК и обратной транскрипции, а также для нормализации количества РНК в образцах проводили ПЦР с праймерами на

« г е н д о м а ш н е г о х о з я й с т в а » G A P D H ( f o r w a r d p r i m e r 5 ' - TGCMTCCTGCACCACCAACT, reverse primer 5'-YGCCTGCTTCAC CACCTTC).

ПЦР в реальном времени проводили в 96-луночных оптических плашках с использованием меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб. Реакцию проводили с использованием 2,5-х кратной реакционной смеси с референсным красителем ROX (Синтол). Праймеры и пробы были синтезированы фирмой «ДНК-Синтез» (табл.8).

Амплификация проводилась в ПЦР-амплификаторе Bio-Rad, iQ4, с использованием следующей программы: (1) в течение 4 мин денатурация при 95°С, (2) в течение 15 сек денатурация при 94°С, (3) в течение 15 сек отжиг при 55°С, (4) в течение 15 сек элонгация при 72°С, (5) этапы 2-4 повторяли 50 раз. Экспериментальная работа по изучению экспрессии генов была произвежена на базе лаборатории функциональной геномики Института общей генетики РАН.

Для приготовления стандартов производилось лигирование продуктов амплификации в T-вектор pAL-TA (Евроген). С помощью набора QIAprep (Qiagen) осуществлялось выделение плазмиды. Концентрацию плазмиды изме- ряли на спектрофотометре Eppendorf.

Экспрессию генов-мишеней нормализовали на ген домашнего хозяйства

GAPDH.

В качестве стандартов была использована серия из четырех десятикрат- ных разбавлений.

Таблица 8 Последовательности праймеров и проб, используемые для определения уровня экспрессии генов при помощи ПЦР-РВ

Для подтверждения статистической достоверности данных ПЦР в реаль- ном времени использовали метод 2-ΔΔCT (рис.1)

.

Рис.1. График ПЦР в реальном времени стандартов для гена GAPDH и об- разцов для гена JUNB