Ферменты- и коферменты-аналоги
Известно немало примеров различия ферментов, выполняющих в разных клетках или у разных видов одинаковую функцию. Если химические различия между ними невелики, то мы говорим об изоферментах, а если они велики, то о ферментах- аналогах.
А. Изоферменты. Многие ферменты при электрофорезе разделяются на некоторое число изоферментов, отличающихся друг от друга по физическим свойствам, но обладающих одинаковой специфичностью. Одним из наиболее известных примеров такого рода является лактатдегидрогеназа (ЛДГ), существующая в животных тканях в виде пяти изоферментов. Все они представляют собой тетрамеры, построенные из двух полипептидов А и В: В4, АВ3, А2В2, А3В и А4. Несколько изоферментов имеют креатинкиназа и аргининкиназа. Изоферментный состав обычно одинаков для одной и той же ткани разных видов млекопитающих, однако даже у одного вида отличается от ткани к ткани.
Избирательное ингибирование отдельных изоферментов описано в разд. 9.4.6 (МАО) и 9.7.1 (лактатдегидрогеназа). Тимидинкиназа, катализирующая фосфорилирование тимидина, имеет два изофермента, один из которых находится в цитоплазматической, а другой в митохондриальной фракциях клетки млекопитающих. В тканях здорового взрослого человека преобладает митохондриальная форма, тогда как цитоплазматический изофермент преобладает в опухолях [Lee, Cheng, 1976].
Б. Ферменты-аналоги. Если изоферменты отличаются друг от друга величиной электрического заряда, то отличия ферментов-аналогов (выполняющих одну и ту же функцию в разных организмах) более существенны. Эти ферменты называются также изофункциональными, эквифункциональными или гомологичными. Их отличия друг от друга позволяют создавать избирательные лекарственные вещества. Ферменты-аналоги могут отличаться по кинетическим параметрам, электрофоретической подвижности и специфичности (по субстратам, коферментам или ингибиторам).
В качестве примера ферментов, отличающихся по субстратной специфичности, можно привести гексокиназы: для некоторых из них субстратом служит только одна гексоза, тогда как другие могут фосфорилировать несколько углеводов. Существуют различия и в коферментах, особенно металлах. Так, железо необходимо для кристаллической альдолазы дрожжей, плесени [Warburg, Christian, 1943] и бактерий Clostridium perfringens [Bard, Gunsalus, 1950], а ферменты-аналоги млекопитающих, растений и трипаносом в нем не нуждаются [Taylor, Green, Cori, 1948]. Семейство ферментов — супероксидисмутазы, существующие как у прокариот, так и у эукариот, — отличаются друг от друга тем, что у одних в активном центре фермента находится магний, а у других — медь; более того, некоторыеимеют изоэлектрическую точку около 4,5, другие — около 8 [Oberley, 1982].
Существуют два различных класса ферментов, известных под названием ФДФ-(фруктозо-1,6-дифосфат) альдолазы, действующих на различных стадиях гликолиза: ферменты животных и высших растений расщепляют ФДФ через основания Шиффа, тогда как ферменты бактерий и грибов требуют наличия металла (обычно Zn2+), связанного с карбонильной группой фермент-субстратного комплекса. Для второго типа ферментов существуют специальные ингибиторы [Lewis, Lowe, 1973]. О ферментах-аналогах см. разд. 11.1 и 4.4. Из табл. 4.6 видно, как лекарственные вещества, содержащие сурьму, по-разному взаимодействуют с двумя ферментами-аналогами, один из которых принадлежит червю-паразиту, а другой — хозяину-млекопитающему. Эти различия лежат в основе классического лечения шистосоматозов.
В основе избирательности некоторых лучших современных противомалярийных и противобактериальных препаратов лежит способность различных диаминопиримидинов различать формы- аналоги фермента дигидрофолатредуктазы (см. разд. 4.0, табл. 4.1 и 4.2 и разд. 9.3.3 и 9.6). Рассмотрим сначала различия между некоторыми нечувствительными к триметоприму (4.9) ферментами позвоночных, а затем перейдем к ферментам беспозвоночных, чувствительность которых к этому препарату очень высока.
Аминокислотная последовательность фермента печени курицы только на 75% совпадает с таковой для фермента печени быка. Более того, гидроксид метилртути двенадцатикратно активирует фермент птицы, тогда как фермент быка он ингибирует. В ферменте птицы значительно больше основных аминокислот и его изоэлектрическая точка 8,4, а у фермента быка 6,8. Такое отличие вызвано тем, что в ферменте птиц в положениях 32, 106 и 154 находится остаток лизина, а в ферменте быка в этих положениях находятся соответственно остатки глицина, треонина и глутаминовой кислоты [Kumar et al., 1980].Независимо от источника, дигидрофолатредуктаза (ДФР) имеет в 27-м остатке или рядом с ним кислотную группу: например, у Е. coli это Асп-27. У прокариот это всегда аспарагиновая кислота, а у эукариот — глутаминовая. Это различие очень важно, так как в ферменте прокариот именно аспарагиновая кислота связывается с 2-NH2 2,4-диаминопиримидиновых ингибиторов [Bolin et al., 1982].
ДФР позвоночных содержит в положении 31 тирозин вместо менее объемного лейцина в положении 27 фермента бактерий; эти остатки образуют карман, в который входит птеридиновое кольцо. Ферменты позвоночных содержат около 185 остатков, тогда как ферменты бактерий—'только около 165. К чему приводит это различие, хорошо видно на примере фермента печени курицы. На конце складчатой структуры этого фермента имеются три дополнительные петли, в которых не образуется нормаль- 173
/
/
ных межцепочечных водородных связей [Volz et/ al., 1982]. В отличие от ДФР фермент млекопитающих способен восстанавливать как фолат, так и дигидрофолат. ‘
ДФР малярийного паразита имеет значительно большую ОММ (103 000—210 000), чем ферменты бактерий (17 000) и позвоночных (21 000). Более того, он обладает и другой ферментативной активностью — тимидилатсинтетазной (метилирование кольца урацила).
В работе Volz и сотр. (1982) приведена аминокислотная последовательность для семи молекул ДФР: трех ДФР бактерий, трех ДФР печени (курицы, свиньи и быка) и одной опухолевой (лимфома мыши).
Ферменты бактерий и высших животных имеют только 25 общих остатков.Различная локализация и связывание метотрексата и ингибиторов ряда диамино-пиримидинов и -триазинов с этими ферментами-аналогами описаны в разд. 9.3.3 и показаны на стереодиаграмме.
АХЭ червя Haemonchus contortus, паразитирующего в кишечнике овец, необратимо ингибируется широко применяемым антигельминтным препаратом фосфорорганического ряда галоксоном (13.36). В то же время АХЭ кишечника овец ингибируется незначительно и быстро восстанавливается. Было показано, что черви, устойчивые к действию галоксона, имеют фермент, отличный от фермента Haemonchus [Lee, Hodsden, 1963]. Структура чистой глутаматдегидрогеназы Trypanosoma cruzi значительно отличается от структуры фермента млекопитающих [Juan et al., 1978].
Казалось бы, что одни и те же ферменты у двух различных видов млекопитающих должны быть идентичны, однако в действительности они только аналогичны. Например, аденилаткина- за мышцы кролика инактивируется 0,8 мМ И6-йодацетамидогек- силаденозин-5'-фосфатом, однако на соответствующий фермент мышцы свиньи 2,8 мМ раствор этого соединения не действует [Hampton, 1976].
Кроме межвидовых различий, существуют различия и в соотношении ферментов в различных тканях одного организма, даже в таких родственных, как сердечная и скелетная мышцы (табл. 4.3).
Многие ферменты млекопитающих встречаются лишь в определенных органах (табл. 4.4). Чем больше специализирована ткань, тем более индивидуален набор ее ферментов. Например, АТФаза желудка блокируется только омепразолом [Gustavsson, 1983].
Между ферментами-аналогами имеются и химические различия. Так, фермент, гидролизующий циклический аденозинмоно- фосфат (цАМФ), в различных тканях млекопитающих имеет разное молекулярное строение [Weiss, Fertel, 1977]. Отметим также, что пируваткиназа из здоровой печени (Пе) почек (По) и мышцы (М) крысы по-разному ингибируется различными ин-
\
Т аб лица 4.3. Соотношение ферментов в мышцах (крысы) \ (Dixon, Webb, 1979]
| \ \ Фермент | Сердечная мышца | Скелетная мышца |
| Цитратсинтаза | 12 | 1 |
| Еполаза | 1 | 8 |
| Фруктозодифосфатаза | 45 | 1 |
| NADH-дегидрогеназа | 35 | 1 |
| Пируваткиназа | 1 | 8 |
Таблица 4.4.
Ферменты, встречающиеся преимущественно в определенных органах млекопитающих (крыса) [Dixon, Webb, 1979]| Фермент | Орган |
| Аргиназа Кислая фосфатаза Щелочная фосфатаза Карбоксиэстераза Р-Глюкуронидаза Глюкозаминфосфатизомераза Маннозидаза Глутаминсинтетаза Рибонуклеаза | Печень Предстательная железа, почки, печень, сердце Почки Поджелудочная железа Селезенка Кишечник Эпидермис Мозг, печень Поджелудочная железа |
гибиторами. Для З'-метокси-АДФ соотношение ингибирующей активности (Пе) : (По) : (М) составляет 1 : 7,6: 6, для 8-диэтил- аминоАДФ 1:1,2:7,1 и для метил- (М-ацетил-