ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Одной из наиболее актуальных задач биологической науки является сохранение биоразнообразия, важным компонентом которого является генетическое разнообразие культурных и дикорастущих видов растений.

Существует несколько способов хранения in vitro, самым распространенным является депонирование пробирочных растений в условиях низких положительных температур (Reed, 1992; Высоцкая, 1994; Дунаева, Гавриленко, 2007). C другой стороны, условия длительного хранения in vitro при низких положительных температурах могут воздействовать на растения как стрессовый фактор. В связи с этим раскрытие механизмов устойчивости и выявление физиолого-биохимических признаков, коррелирующих с устойчивостью растений к воздействиям условий хранения in vitro, приобретают особую актуальность.

Поскольку условия хранения in vitro могут оказывать на растения стрессовое воздействие, предполагается, что во время хранения при пониженной температуре в растительном организме включается система ответных реакций на стрессоры. Как правило, большинство различных стрессовых воздействий вызывает в организме также и окислительный стресс. Известно, что в ответ на многие стрессовые факторы у растений может происходить образование активных форм кислорода (АФК) (Foyer, Noctor, 2005). Накопление АФК в клетках может приводить к окислительному повреждению макромолекул, в том числе и к нарушениям структуры ДНК. Одним из важных элементов в системе окислительно- восстановительных реакций клеток является аскорбиновая кислота (Pignocchi, Foyer, 2003). Аскорбиновая кислота как антиоксидант также играет важную роль при утилизации пероксида водорода, который является одной из активных форм кислорода. В ответных реакциях на окислительный стресс огромную роль также играют пероксидазы - ферменты, которые катализируют реакцию окисления разных субстратов, используя в качестве окислителя пероксид водорода (Fujiyama et al., 1995; Шарова, 2004).

Во многих исследованиях показана осморегуляторная роль пролина, содержание которого возрастает в десятки и сотни раз при действии на растения неблагоприятных факторов внешней среды (Goring, 1979; Rui et al., 1980). Заметное увеличение содержания свободного пролина в различных органах растений при стрессах вызывает интерес многих исследователей в связи с возможностью использования этого показателя в качестве биохимического маркера в защитных реакциях растений. Однако до сих пор еще не изучена его динамика в процессе длительного хранения растений in vitro при низких положительных температурах.

Цель настоящей работы заключалась в изучении особенностей микроразмножения и длительного хранения в условиях in vitro различных сортов ежевики, малины и земляники, а также анализ динамики морфофизиологических и биохимических показателей сохраняемых микрорастений.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить меж-, внутривидовую изменчивость по способности к клональному микроразмножению и способность различных сортов малины, ежевики, земляники к длительному хранению in vitro.

2. Изучить динамику морфологических показателей микрорастепий различных сортов ежевики, малины и земляники, сохраняемых в условиях длительного хранения in vitro.

3. Проанализировать изменения биохимических показателей (уровня хлорофиллов а и Ь, свободного пролина, аскорбиновой кислоты, пероксида водорода, а также активности пероксидаз) у сохраняемых при +4^oC микрорастений ежевики.

4. Провести молекулярный анализ микрорастений различных сортов ежевики и малины после длительного низкотемпературного хранения in vitro и исходных растений аналогичных сортов с помощью RAPD-метода.

Научная новизна. Впервые был проведен комплексный анализ морфофизиологического состояния хранящихся в условиях in vitro при пониженной температуре микрорастений различных сортов ежевики, малины и земляники. Впервые исследована динамика уровня свободного пролина, хлорофиллов, аскорбиновой кислоты, пероксида водорода и активности пероксидаз в микрорастениях ежевики, хранящихся в условиях in vitro при +4^oC. Изучена взаимосвязь между изменением содержания пероксида водорода и активностью пероксидаз во время хранения in vitro микрорастений ежевики при +4^oC. Полученные в данной работе результаты способствуют пониманию механизмов ответно-приспособительных реакций растительного организма на стрессовые воздействия условий депонирования in vitro растений. Проведен молекулярный анализ микрорастений, сохраняемых в условиях in vitro, и исходных растений; не выявлено различий в их ТМРО-спектрах.

Практическая ценность. Определены физиолого-биохимические параметры растений, которые могут использоваться для выявления более устойчивых к условиям хранения in vitro образцов.

Для оценки выживаемости микрорастений ежевики в условиях низкотемпературного хранения в качестве экпресс-теста предложен мониторинг уровня пероксида водорода.

Модифицирован метод выделения и очистки ДНК растений ежевики и малины.

Апробация работы. Основные положения представлены на конференции молодых ученых и аспирантов в СЗНМЦ PACXH «Формирование конкурентоспособности молодых ученых» (Пушкин, Санкт-Петербург, 2006), II Вавиловской международной конференции «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы» (Санкт-Петербург, 2007), Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века» (Петрозаводск, 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работ, в том числе 1 статья и 3 тезисов докладов на международных конференциях.

1.