Микроклональное размножение и хранение растений в культуре in vitro

Очень многие ценные ягодные культуры, могут стабильно воспроизводиться только при вегетативном размножении. Это связано с тем, что их высокая гетерозиготность не позволяет хранить коллекции в виде семян, так как половое размножение нарушает “генетическую структуру” сорта.

В мировой практике получение стерильных культур и культивирование микрорастений в условиях in vitro является наиболее широко используемым способом сохранения вегетативно размножаемых растений в контролируемых условиях среды. При этом сохраняется надежная изоляция, сохранность генотипа от возможных патогенов и действия экстремальной абиотических факторов среды. Особая компактность пробирочной коллекции очень удобна для интродукции и обмена материалом между генбанками (Бутенко, 1964; Щелкунова, Попов, 1970; Попов, 1979; Высоцкий, 1986; Гавриленко и др., 2007; Дунаева, Гавриленко, 2007).

Еще одним важным преимуществом методов культуры in vitro является возможность оздоровления растений от патогенов. Наибольшее распространение получил способ оздоровления посадочного материала через культуру меристем изолированных апексов (Лутова, 1999; Дунаева, Гавриленко, 2007). Этот метод основан на неодинаковой концентрации вирусных частиц в различных органах растения. Минимальная концентрация вирусов или полное их отсутствие характерно для точек роста. Причина этого явления, вероятно, связана с понижением концентрации вирусных частиц в активно делящихся меристематических клетках, что связано с отсутствием в меристемах развитой сосудистой системы и специфичным соотношением фитогормонов (Петрова, Упадышев, 2002).

C помощью методов электронной микроскопии и флуоресцирующих антител была показана специфическая апекальная невосприимчивость для комбинации «растение-вирус». На основании этих исследований был рекомендован оптимальный размер эксплантов - 0,1-0,3 мм, который может быть увеличен, если иммунная зона окажется больше. Однако даже в присутствии вирусных частиц в меристематических клетках возможна регенерация безвирусных растений. Этот факт может быть объяснен конкуренцией в использовании субстратов при синтезе растительных и вирусных нуклеопротеидов и присутствием ингибиторов, например, таких как фениламины (Mellor, 1989). Однако пока ни одна из этих гипотез не может полностью объяснить все имеющиеся факты оздоровления растений через культуру апикальных меристем.

Безвирусный посадочный материал можно также получить путем регенерации растений в каллусной культуре. Именно таким путем удалось получить безвирусные регенеранты многих видов растений (Cassels, 1991). Для тех видов растений, у которых отсутствуют вирусы, переносимые пыльцой, например, для земляники, получение оздоровленного посадочного материала возможно и с помощью культуры пыльников (Петрова, Упадышев, 2002).

При создании и хранении коллекций безвирусных растений in vitro неизбежным является их микроклональное размножение. В результате различных манипуляций, таких как отбор внешне здоровых образцов, проведение термообработки и хемообработки, культура меристем и/или изолированных апексов и иных приемов, на выходе получаются единичные здоровые экземпляры. Методы клонального микроразмножения растений позволяют быстро размножить безвирусные клоны растений (Щелкунова, Попов, 1970; Атанасов. 1993; Суркова, Приходько, 1995).

Метод клонального микроразмножения растений в культуре in vitro является способом массового бесполого размножения растений в культуре тканей и клеток (Катаева, Бутенко, 1983; Катаева, 1984; Олешко, 1985; Высоцкий, 1986; Дорошенко, Кострикин, 1989; Стрыгина, 1990; Туровская, Стрыгина, 1990; Гавриленко и др., 2007).

Первый способ микроклонального размножения заключается в получении растений-регенерантов из каллусной ткани путем органогенеза или соматического эмбриогенеза. Эта модель несет в себе наибольшую возможность генетической изменчивости растений-регенерантов, поскольку последние образуются из меристематических новообразований, возникающих в популяции дезинтегрированных клеток, так называемых каллусных клеток, как правило, генетически гетерогенных. Этот способ обычно используется для получения генетически измененных растений-регенерантов, которые называются сомаклональными (Лутова, 1999; Минаев и др., 2004).

Вторая модель микроклонального размножения - это индукция развития побегов непосредственно из ткани экспланта (Лутова, 1999). Способность к индукции адвентивных почек в обычных условиях встречается у некоторых видов растений, что используется для их размножения. Условия культивирования in vitro могут в сильной степени стимулировать этот процесс. Так, при размножении in vitro наблюдалось формирование адвентивных почек и побегов на листовых пластинках и черешках земляники, листовых пластинках малины (Минаев и др., 2004).

Наибольшее распространение получила третья модель размножения - пролиферация пазушных побегов, основанная на снятии апикального доминирования (Лутова, 1999). Этот метод уже стал применяться для промышленного производства посадочного материала некоторых культур, и в настоящее время является наиболее надежным в отношении размножения плодовых, ягодных культур и декоративных кустарников. В деталях этот метод впервые был отработан на землянике в начале 70- х годов прошлого столетия (Boxus, 1974).

Последний метод имеет ряд чрезвычайно важных преимуществ: за короткий срок возможно получение огромного количества однородного посадочного материала (коэффициент микроразмножения достигает до IO⁵-IO⁷ растений в год); ускоряется селекционный процесс, сроки получения товарной продукции новых сортов уменьшаются до 2—3 лет вместо 10-12; возможно поддержание роста растений круглый год; удается размножать растения, которые в обычных условиях размножаются с трудом или совсем не размножаются вегетативно, возможно в кратчайшие сроки получить большое количество растений при ограниченном количестве исходного материала практически без контакта с внешней средой, что существенно снижает риск реинфицирования оздоровленного материала в процессе размножения (Бургутин и др., 1983; Высоцкий, 1998).

Пролиферация пазушных побегов основана на снятии апикального доминирования, что может осуществляться двумя путями. Во-первых, получение побегов нормальных пропорций с последующим их делением на однопочковые микрочеренки, которые используются в качестве вторичных эксплантов для повторения цикла размножения. Теоретически возможность такого способа размножения составляет до 1 млн. побегов из одного побега в год, при условии, что за два месяца можно получить один побег, дающий 10 микрочеренков. Во-вторых, путем снятия апикального доминирования за счет введения в питательную среду веществ с цитокининовой активностью. Это приводит к формированию побегов с относительно укороченными междоузлиями, а пазушные почки дают начало новым побегам. На таких средах экспланты приобретают вид «щетки» из маленьких побегов, каждый из которых может быть рекультивирован (Высоцкий, 1998).

Метод микроконального размножения с помощью пролиферации пазушных побегов имеет минимальную степень риска в отношении получения неоднородного потомства, а частота появления мутантных растений (в расчете на число новообразований) не превышает появления таковых при обычном размножении. Указанный метод микроклонального размножения широко применяется при поддержании коллекций растений in vitro в клональных генбанках, поскольку главной задачей при этом является сохранение генетической стабильности хранящихся образцов (Коротаева и др., 1975).

Одними из широко применяемых способов поддержания in vitro культур являются методы хранения растений в условиях их минимального роста (Романова, Ульянова, 1990; Высоцкая, 1994; Лугова, 1999; Гавриленко и др., 2007). Эта группа методов базируется на хранении культур побегов или пробирочных растений, полученных из меристем, в условиях, которые обеспечивают только минимальный рост. Преимущества этих методов заключаются в том, что материал всегда доступен для дальнейшего использования, визуальный контроль позволяет оценить его жизнеспособность, хранящиеся культуры могут легко заменяться при необходимости (Лутова, 1999; Гавриленко и др., 2007; Дунаева, Гавриленко, 2007).

Обеспечение минимального роста может быть достигнуто несколькими путями, прежде всего, изменением физических условий культивирования (температуры, состава газовой среды, спектрального состава света). Вторым приемом является изменение состава культуральной среды за счет удаления или снижения концентрации факторов, необходимых для нормального роста растений. На практике хранение единичных побегов или укорененных растений осуществляют на агаризованной или жидкой среде с пониженными концентрациями регуляторов роста при нормальной или низкой (4÷l^θC) температурах. Для каждого вида растений приемы хранения в условиях минимального роста подбирают индивидуально. Очень эффективным способом замедления роста и, таким образом, увеличения сроков беспересадочного хранения растений, является их выращивание при пониженной температуре (до +4^oC) в небольшом объеме газовой и питательной среды и измененном фотопериоде (Renaut, 2004; Гавриленко и др., 2007). Длительное хранение in vitro растений может оказывать неблагоприятное влияние на развитие растений-регенерантов. Так, в работе Л. В. Алексеенко и др. (2008) показано, что после длительного хранения в течение 4 лет регенрационная спасобность микрорастений земляники значительно снижается.

В настоящее время способ хранения микрорастений при пониженных температурах широко применяется, и имеются данные о различной способности культур к выживанию в условиях низкотемпературного хранения.

Ряд работ посвещен изучению влияния питательных сред, фаз развития экспланта и сортовых особенностей на сохранение жизнепособности регенерантов земляники в условиях пониженных температур (l-4^oC) в темноте (Туманов, 1979; Захаренко, Сучкова, 1988; Чернец и др., 1988). В этих работах отмечается, что продолжительность хранения в условиях пониженных температур в темноте в среднем составляет 6—10 месяцев. В зависимости от состава питательной среды, фаз развития экспланта и сорта продолжительность хранения увеличивается до 2—3 лет.

Л. В. Алексеенко и сортудники (2008) также изучали различные сорта земляники при депонировании микрорастений при пониженных температурах. Показано, что во время хранения 48 сортов земляники при +4°C и полной темноте на безгормональной среде Мурасиге и Скуга через год хранения выживает большинство микрорастений изученных сортов за исключением сортов Зенит (40%) и Reine des Valles (50%), у остальных сортов процент жизнеспособных растений колеблется от 70 до 100%. Также показано, что отдельные сорта могут выживать до 4 лет, сохраняя при этом от 10% до 60% микрорастений (Алексеенко, 2008).

В работе Н. П. Романовой и Е. К. Ульяновой была изучена продолжительность хранения растений-регенрантов 12 сортов земляники в условиях полной темноты и освещенности 500-800 лк при температуре 1^4^oC на среде Мурасиге и Скуга с половинным составом минеральных солей и с добавлением 0,5 мг/л ИУК и 20 г/л сахара (1990). Спустя два года хранения в этих условиях количество выживших микрорастений на свету составляло 87%, а в условиях темноты все растения погибли. Показано, что микрорастения, хранящиеся в условиях освещенности могут быть восстановлены и сохранены минимум в течение трех лет, в темноте - один- полтора года. При хранении микрорастений идет естественный процесс отмиранеия листьев (Романова, Ульянова, 1990). В этой связи ниличие на растении зеленых листьев является показателем жизнеспособности растений при хранении in vitro. Так, через год хранения у растений земляники, хранящихся в условиях освещенности количество зеленых листьев, составляло около 62%, в темноте — 40%.

Таким образом, удлинение сроков хранения микрорастений в условиях минимального роста можно обеспечить изменением условий культивирования.

1.2.