Причины и механизмы сомаклоналъной изменчивости

К сомаклоналъной относится изменчивость, возникающая в культурах изолированных клеток и тканей, регенерирующих растениях и их потомках. Согласно Ларкину, «культура растительных клеток сама генерирует сомаклональную изменчивость» (Larkin, 1998).

В связи с этим, в культуре клеток и тканей растений регистрируются изменения, характерные для клеток находящихся в состоянии стресса. Эти изменения происходят на уровне физиологических характеристик (гормон- независимый рост клеток, высокий уровень клеточных делений, ослабление клеточной адгезии); морфологических характеристик (недоразвитие клеточных стенок, недостаточное развитие хлоропластов и митохондрий, возникновение крупных неправильной формы ядер со многими ядрышками, формирование апоптотических телец) и биохимических характеристик (уменьшенное содержание тетрапиррольных соединений, постоянный окислительный стресс, низкая продукция этилена, накопление полиаминов, усиление пентозофосфатного пути глюкозы) (Gaspar et al., 2002).

Известно, что в ответ на многие стрессовые факторы у живых организмов, включая растения, может происходить образование активных форм кислорода (АФК) (Foyer, Noctor, 2005). Основные механизмы появления АФК в организме связаны обычно с нарушениями функционирования электронно-транспортных цепей митохондрий и хлоропластов (см. стр. 42). В аэробных клетках в процессе присоединения одного электрона к молекуле кислорода образуются супероксидный анион-радикал (O₂*^) и его протонированная форма - гидроперекисный радикал (HO₂*^-); °ба они порождают ряд других активных форм кислорода.

В живых организмах существует физиологически нормальный уровень свободнорадикальных процессов и перекисного окисления липидов, необходимый для регулирования липидного состава, проницаемости мембран и ряда биосинтетических процессов. Однако в стрессовых условиях накопление АФК в клетках может вызывать окисление мембранных липидов, модификации белков, ингибирование ферментов (Подколзин и др., 2000; Cassells, Curry, 2001).

Супероксидные радикалы, вызывая окислительное повреждение макромолекул, замедляют интенсивность деления клеток и нарушают клеточный цикл (Wiseman, Halliwell, 1996), а также могут приводить к программированной клеточной смерти (апоптозу) (Polyak et al., 1997). Например, показано, что высокий уровень АФК в клетках может активировать запуск процесса запрограммированной клеточной смерти (Mitsuhara, 1999). Хорошо известно, что с возрастом в тканях человека и животных повышается содержание продуктов окислительного повреждения макромолекул, в том числе ДНК; накопление АФК может приводить к разрывам хроматина и нарушению структуры ДНК (Гродзинский и др., 1987; Коган и др., 1992; Ozawa, 1997; Azzi et al., 2004). Экспериментальные доказательства о повреждениях ДНК (однонитевых и двунитевых разрывов) и нарушении процессов репарации в клеточной культуре лимфоцитов под действием АФК получены в недавней работе Muniz и др.

Следует отметить, что пероксид водорода может участвовать в активации эндонуклеаз и в последующем повреждении ДНК (Hagar et al., 1996). C другой стороны, пероксид водорода способен диффундировать через мембраны и выполнять роль протекторов от других видов стресса, например, фитопатогенных инфекций.

Стрессовые условия клеточных и тканевых культур, которые перечислялись выше, также могут индуцировать окислительный стресс, приводя к накоплению АФК, что позволяет предполагать участие окислительного стресса в индукции сомаклональной изменчивости у растений (Cassells, Cury, 2001).

Для объяснения возникновения сомаклонов предложены разные генетические механизмы: изменение характера метилирования хроматина, амплификация ДНК, активация мобильных генетических элементов.

В клетках растений, регенерировавших из тканевых культур, могут происходить хромосомные аберрации (транслокации, инверсии, делеции и дупликации). Возникновение хромосомных перестроек чаще всего обусловлено рекомбинационными механизмами (Wilkinson., 1992; Phillips et al., 1994), в том числе митотическим кроссинговером в местах частичной гомологии негомологичных хромосом или результатом разрывов хромосом под воздействием повреждающих агентов: различных химических мутагенов, отдельных компонентов среды, вирусов и т. д., а также в случае активации мобильных генетических элементов (Planckaert, Walbot, 1989; Hirochika, 1993; Wessler, 1996). Было показано, что на частоту сестринских хроматидных обменов, регистрируемых в культуре клеток пшеницы (Triticum aestivum} влияет соотношение ауксинов и цитокининов в питательной среде (Murata, 1989). В качестве другого механизма возникновения хромосомных перестроек предложена задержка репликации гетерохроматиновых участков, сопровождающаяся появлением хромосомных мостов и разрывов (Phillips et al., 1994). В клетках каллусных культур Crepis capillaries хромосомные разрывы выявляли в поздно реплицируемых гетерохроматиновых областях хромосом (Jain et al., 1998).

На молекулярном уровне, одним из часто наблюдаемых проявлений сомаклональной изменчивости являются амплификации и деамплификации различных последовательностей ДНК (Brar, Jain, 1998). Было показано также, что различные последовательности генома могут быть подвержены сомаклональной изменчивости в разной степени (Linacero et al., 2000). Среди растений-регенерантов из культуры тканей кукурузы (Brettel et al., 1986) и среди регенерантов томата (Landsmann, Uhrig, 1985) выявлены сомаклоны с делениями в последовательностях рибосомальной РНК. Повышенный уровень нестабильности в тандемно повторяющихся последовательностях часто выявляется в культуре тканей и у регенерантов, возможно, из-за повышения уровня митотической рекомбинации в этих районах. По мнению Phillips et al. (1994) изменения числа копий тандемно повторяющихся последовательностей в культивируемых клетках может быть следствием стрессов, обусловленных условиями культуры in vitro.

6.1.2.