СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ
Цитохромоксидаза - основная терминальная оксидаза. Фермент локализован главным образом в митохондриях, в качестве простетической группы содержит гематин. В составе цитохромоксидазы кроме железа гема обнаружена и медь.
Цитохромоксидаза осуществляет окисление восстановленных цитохромов. Активность этого фермента определяют спектрофотометрическим методом, который основан на измерении оптической плотности раствора восстановленного цитохрома с, имеющего максимум поглощения при 550 нм [1]. Показателем активности служит величина падения оптической плотности раствора за определённый промежуток времени.Реактивы
1. 0,15 М фосфатный буфер с pH 7,4.
2. Восстановленный 2,5‘10’5- 5'10’5М раствор цитохрома с; вначале готовят исходный раствор цитохрома с (например, 52 мг растворяют в 25 см3 бидистиллированной воды), затем берут 3 см3 приготовленного раствора и смешивают его с 17 см 3 буфера с pH 7,4, восстанавливают смесь небольшим количеством (70 мг) гидросульфита (на кончике ланцета), при этом образуется розовая окраска; избыток гидросульфита удаляется окислением кислородом воздуха путём встряхивания в течение 5-10 мин; получение восстановленного раствора цитохрома является важным моментом; проверка степени восстановления может быть проведена на спектрофотометре по Смиту [2].
3. Красная кровяная соль - K3[Fe(CN)6] (ферроцианид калия).
Ход анализа
Навеску растительного материала массой 400-600 мг тщательно растирают в охлажденной ступке с холодным фосфатным буфером с pH 7,4. Растертую массу переносят в мерную колбу емкостью 50 см3 и доводят фосфатным буфером до метки. Вытяжку центрифугируют в течение 15 минут при 3000-4000 об/мин на центрифуге с охлаждением. Для определений используют охлажденный центрифугат. Все ферментные вытяжки (центрифугаты) до измерения должны находиться в сосуде со льдом.
Измерение оптической плотности опытного раствора проводят при 550 нм. Вначале по контрольному образцу устанавливают стрелку амперметра прибора в нулевом положении. Контрольный образец содержит 1,5 см3 вытяжки и 1,5 см3 фосфатного буфера с pH 7,4. При работе с митохондриями берут их взвесь в фосфатном буфере и среду выделения в соотношении 1:2 или 2:1 (общий объём 1,5 см3) и добавляют 1,5 см3 буферного раствора.В опытную кювету вносят 1,5 см3 ферментной вытяжки (центрифугата) или взвеси митохондрий и добавляют 1,5 см3 восстановленного цитохрома с. Первое измерение оптической плотности после приливання восстановленного цитохрома с производят через 30 с, а зазатем через 1-2 мин в течение 5-10 мин или другого интервала времени в зависимости от активности фермента. Между отсчетами проверяют настройку прибора по контрольной кювете. При окислении цитохрома с цитохромоксидазой оптическая плотность раствора падает. По истечении времени опыта для полного окисления оставшегося неокисленным цитохрома с в кювету добавляют 1-2 кристаллика феррицианида калия K3[Fe(CN)6], встряхивают и вновь измеряют плотность раствора при 550 нм. Расчет активности фермента производят по формуле:
где А - активность цитохромоксидазы, выраженная в условных единицах;
D, - оптическая плотность исследуемого раствора в начале опыта (первое измерение);
D2 - оптическая плотность раствора в конце опыта;
D3 - оптическая плотность раствора после окисления цитохрома красной кровяной солью;
t - время (0 - от начала опыта, t2 - конечное), мин.
Результаты выражают на единицу сырой массы или на единицу белка. Литература
1. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П., Перуанский Ю.В., Луковнико- ва Г.А., Иконникова М.И. Методы биохимического исследования растений.-Л.: Агропромиздат, 1987. С.45-47.
2. Smith L.H Meth. Biochem. 1955. Vol.2. P. 427-435.