ПУТИ РЕГУЛИРОВАНИЯ УРОВНЯ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОДУКТОВ И АКТИВНЫХ КИСЛОРОДНЫХ МЕТАБОЛИТОВ

Регулирование уровня активных кислородных метаболитов и свободнорадикальных продуктов ПОЛ осуществляется анти­оксидантными системами, снижающими активность радикаль­ных окислительных процессов.

Различают превентивные антиоксиданты (пути: П — измене­ние структурной организации субстрата, замедляющее окисле­ние; IV — снижение концентрации О₂; VI — связывание или окис­ление ионов металлов переменной валентности, индуцирующих разложение пероксидов и образование радикалов; VII — перевод пероксидов в стабильные продукты окисления: спирты, альдеги­ды, кетоны) и ингибиторы АКМ (пути: I — ингибирование ради­кальных форм АКМ, способных инициировать образование орга­нических радикалов; III и V — прерывание окислительной цепи посредством взаимодействия с органическими радикалами). Дей­ствие ингибиторов АКМ является специфичным.

Часто антиоксиданты классифицируют в соответствии с ве­личинами их молекулярных масс. К группе высокомолекуляр­ных соединений — ферментов антиоксидантной защиты и бел­ков, связывающих катализаторы свободнорадикальных процес­сов — ионы Fe и Си, относят соответственно супероксиддисмута- зу (СОД), церулоплазмин, пероксидазу, каталазу, глутатионзави- симые ферменты и альбумин крови, трансферрин, ферритин. Груп­пу низкомолекулярных антиоксидантов составляют а-токоферол, аскорбат, глутатион, мочевая кислота, мочевина, билирубин, не­которые аминокислоты.

Ферментативные антиоксиданты (АО) характеризуются вы­сокой специфичностью действия, а также клеточной и органной локализации, использованием в качестве катализаторов некото­рых металлов (Си, Zn, Fe, Se). Уровень внутриклеточных фер­ментативных АО находится под генетическим контролем.

Супероксиддисмутаза (КФ 1.15.1.11, СОД) катализирует реак­цию дисмутации супероксидного анион-радикала: 2О,,'~ + 2Н⁺ -» Н₂О₂ + О₂. Обнаружено несколько изоферментов этого белка, раз­личающихся локализацией, строением активного центра и не­которыми физико-химическими свойствами. Си, Zn-содержащая СОД чувствительна к цианиду и содержится в цитозоле и в меж­мембранном пространстве клеток эукариот. Цианидрезистент- ная Мп-СОД (железосодержащий изофермент) локализована в митохондриях эукариот и найдена у прокариот. В плазме содер­жится цианидчувствительная экстрацеллюлярная СОД, представ­ляющая собой Си, Zn-содержащую тетрамерную молекулу (Mr -120—135 кДа) из четырех гликопротеиновых субъединиц. Предполагают, что экстрацеллюлярная СОД выполняет функцию защиты клеток эндотелия во всем организме. Однако активность СОД в плазме крови намного ниже, чем для цитозольного фер­мента. По-видимому, это связано с накоплением конечного про­дукта реакции — пероксида водорода, являющегося ингибито­ром фермента. В клетках пероксид водорода быстро разрушает­ся внутриклеточными каталазой и глутатионпероксидазой.

Несмотря на высокую специфичность фермента, в определен­ных условиях Cu-СОД может взаимодействовать с пероксидом водорода и выступать в качестве прооксиданта, инициируя обра­зование радикалов 0,7 и ОН":

В настоящее время исследуются возможности клинического применения СОД, обладающей выраженным защитным эффек­том при воспалительных, ишемических и стрессовых поражени­ях. С целью повышения стабильности фермента и предотвраще­ния его быстрого разрушения во внеклеточном пространстве ис­пользуют препараты фермента, ковалентно связанного с иммуно­глобулинами, сывороточным альбумином, полиэтиленгликолем.

Каталаза (КФ 1.11.1.6) ускоряет процесс двухэлектронного восстановления пероксида водорода до воды, используя Н₂О₂ как донор электрона. Молекула каталазы состоит из четырех иден­тичных субъединиц и четырех групп гематина. Молекулярная масса фермента из различных источников составляет 225— 250 кДа. Каталаза локализована преимущественно в пероксисо- мах клеток, где ее концентрация достигает - 10“° моль/л. Макси­мальное содержание фермента обнаружено в эритроцитах, пече­ни и почках. Разложение пероксида водорода каталазой осуще­ствляется в два этапа:

В окисленном состоянии каталаза работает и как пероксида- за, катализируя реакции окисления спиртов или альдегидов:

окисленная каталаза + АН₂ —> 1Ге³⁺-каталаза + 2Н₂О + А, где АН₂ - донор электронов.

Церулоплазмин — один из основных антиоксидантов плаз­мы, проявляющий как специфическую, так и неспецифическую антиоксидантную активность. Специфическая активность, свя­занная со снижением уровня АКМ, обусловлена реализацией трех возможных механизмов: 1) церулоплазмин обладает феррокси- дазной активностью, окисляя ионы Fe²⁺ без образования супе­роксидного анион-радикала; 2) он способен вызывать дисмута- цию супероксидных радикалов, которая имеет не ферментатив­ный, а стехиометрический характер (это обусловливает ингиби­рование церулоплазмином ПОЛ в липопротеинах); 3) церулощ лазмин инактивирует АФК, генерируемые миелопероксидазой, и тем самым защищает антипротеиназу от окислительного повреж­дения гипохлоритом.

Неспецифическая антиоксидантная активность церулоплаз­мина связана с образованием комплексных соединений с медью, что препятствует возможности их участия в реакциях Фентона и Габер—Вейса.

Антиоксидантной активностью обладает также трансферрин плазмы. Его действие носит в основном неспецифический ха­рактер, обусловленный связыванием ионов железа.

К группе высокомолекулярных антиоксидантов относятся глу- татионзависимые ферменты — глутатионпероксидаза, глутати- онредуктаза, глутатионтрансфераза.

Глутатионперокидаза (КФ 1.11.1.9) эффективно утилизирует токсичные липопероксиды в организме при помощи фермента­тивной реакции

В тканях млекопитающих обнаружены по крайней мере два фермента, способные легко восстанавливать органические гидро­пероксиды. Селенсодержащая глутатионпероксидаза с высокой скоростью утилизирует как пероксид водорода, так и органичес­кие гидропероксиды, в том числе липопероксиды — пероксиды жирных кислот, ацилглицеридов, стероидов и простагландинов. Неселеновая глутатионпероксидаза II, напротив, активно восста­навливает исключительно органические гидропероксиды. Se-co- держащая глутатионпероксидаза локализована в цитозоле (-70 %) и митохондриях (20—30 %) клеток млекопитающих.

В регуляции обмена липопероксидов (рис. 29) важную роль играет сопряженное действие глутатионпероксидазы и глутати- онредуктазы (КФ 1,6.4.1), приводящее к инактивации перокси­дов жирных кислот и превращению их в соответствующие окси­кислоты. Глутатионредуктаза катализирует восстановление окис­ленного глутатиона:

Глутатионтрансферазы (КФ 2.5.1.18) представляют собой груп­пу ферментов, катализирующих начальную стадию биосинтеза меркаптуратов — конъюгацию глутатиона с ксенобиотиками (RX), содержащими электрофильный атом:

Однако продуктом ферментативного превращения некоторых субстратов, в том числе органических гидропероксидов, являет­ся не тиоэфир (RSG), а окисленный глутатион.

Рис. 29. Детоксикация супероксидного радикала, пероксида водоро­да и липопероксидов в тканях млекопитающих

при действии GSH-трансферазы на органические гидроперокси- ды объясняется взаимодействием электрофильного кислорода с тиолатным анионом (GS ), что приводит к возникновению не­стабильного сульфенового производного глутатиона:

которое затем неферментативно реагирует с еще одной молеку­лой GSH:

Глутатионтрансферазы локализованы преимущественно в ци­тозоле клеток; в печени человека они составляют 2—4 % от общего количества цитозольного белка. Глутатионтрансферазы эффективно восстанавливают гидрофобные гидропероксиды с большим объемом молекулы (гидропероксиды линолевой и ара- хидоновой полиненасыщенных жирных кислот, фосфолипидов), а также гидропероксиды мононуклеотидов и ДНК, участвуя тем самым в их репарации.

Считают, что при окислительном стрессе ферментативная ан­тиоксидантная защита оказывается малоэффективной по срав­нению с действием низкомолекулярных соединений. Это связа­но с тем, что ферменты-антиоксиданты локализованы внутри клеток, а в биологических жидкостях обнаруживаются лишь следовые их количества. Кроме того, при оксидативном повреж­дении происходит быстрая инактивация конститутивного пула ферментов свободными радикалами. Поэтому необходимо значи­тельное время для индукции их синтеза. В этих условиях повы­шается роль низкомолекулярных антиоксидантов, не только сни­жающих интенсивность свободнорадикальных процессов, но и выполняющих важные метаболические функции.

Эффективными перехватчиками свободных радикалов явля­ются фенольные антиоксиданты, содержащие ароматическое коль­цо, связанное с одной или несколькими гидроксильными группа­ми.

где АгОН — ароматическое кольцо фенольного антиоксиданта, связанное с гидроксильной группой.

Взаимодействие фенольных антиоксидантов с органически­ми радикалами приводит к образованию феноксильных радика­лов (АгО‘), которые могут участвовать в реакциях диспропорци­онирования с образованием хинолидных пероксидов:

Распад хинолидных пероксидов приводит к образованию хи­нонных форм молекул, которые в нормальных условиях не обла­дают антиоксидантными свойствами, однако при дефиците кис­лорода могут тормозить окисление путем взаимодействия с ал­кильными радикалами:

К фенольным соединениям, обладающим выраженной анти­оксидантной активностью, относят витамины Б (а-токоферол) и К, триптофан, тирозин, фенилаланин, убихиноны, каротиноиды, флавоноиды, фенокарбоксильные кислоты и др. Они ингибиру­ют супероксидный анион-радикал кислорода, синглетный моле­кулярный кислород, гидроксильный радикал и индуцированные ими процессы ПОЛ.

Вместе с тем благодаря способности легко отдавать и захва­тывать электроны фенольные АО могут выступать и в качестве восстановителей. Например, в условиях гипоксии при действии ряда дыхательных ядов в митохондриях убихинон окисляется кислородом с образованием супероксидного анион-радикала, т. е. проявляет прооксидантные свойства. а-Токоферол способен вос­станавливать ионы металлов переменной валентности и действо­вать как прооксидант, в частности, при индуцированном ионами железа окислении липосом. Взаимодействие фенольных АО с пе­роксидами приводит к образованию алкоксильных радикалов, которые могут индуцировать окислительные реакции:

Аскорбиновая кислота способна выступать в качестве донора и акцептора водорода благодаря наличию в ее структуре двух енольных групп. Аскорбат образуется у животных в виде конеч­ного продукта из разветвлений глюкуронатного пути обмена глю­козы. При окислении витамина С в тканях животных и челове­ка образуется дегидроаскорбат, превращающийся затем в дике- тогулонат. При расщеплении последнего образуется щавелевая кислота, а при декарбоксилировании — ксилулоза, превращаю­щаяся в глюкозу. У растений окисление аскорбата с образовани­ем дегидроаскорбата катализирует медьсодержащая аскорбат- оксидаза. Эту же функцию выполняют и другие терминальные оксидазы растительных и животных тканей — цитохромоксида- за, фенолоксидаза, некоторые металлы. Одновременно с окисле- ни-ем аскорбата в организме происходит ферментативное и не­ферментативное восстановление дегидроаскорбата до аскорбата, осуществляющееся при участии восстановленного глутатиона. Второй путь быстрого образования аскорбата в организме — вос­становление монодегидроаскорбата при участии NADH.

Способность аскорбата и дегидроаскорбата легко подвергать­ся окислительно-восстановительным превращениям лежит в основе широкого участия витамина С в обмене веществ: дыха­нии и фотосинтетической активности, транспорте электронов, окислении и восстановлении никотинамидных коферментов.

Аскорбат необходим для нормального развития организма, по­вышает эффективность адаптации к воздействию факторов внеш­ней среды, участвует в обмене белков, липидов, углеводов, уско­ряет процессы регенерации, стимулирует деятельность желез внут­ренней секреции.

Окисленная и восстановленная формы аскорбата способны проникать через мембранные структуры животных клеток. Бла­годаря большей липофильности дегидроаскорбат легко диффун­дирует через биомембраны, чем существенно отличается от ас­корбата. Дегидроаскорбат как транспортная форма витамина С проникает в биологические структуры посредством простой или облегченной диффузии. В нормальных физиологических услови­ях основную роль в процессах трансмембранного переноса и под­держания физиологического уровня аскорбата в клетках играет механизм активного транспорта, опосредованный участием спе­цифических белков и зависящий от наличия энергии.

Аскорбиновая кислота обладает чрезвычайно широким спект­ром антиоксидантных свойств: обезвреживает гипогалоиды, супер­оксидный анион-радикал кислорода, пергидроксильный радикал, пероксидный радикал, синглетный кислород, гидроксильный ра­дикал, восстанавливает а-токоферильный радикал, возвращая а-токоферолу антиоксидантные свойства, а также тиильный (CS') и тиопероксильный (GSO‘_a) радикалы. Витамин С превосходит дру­гие антиоксиданты плазмы крови в защите липидов от пероксид­ного окисления, так как только это соединение достаточно реакци­онноспособно для эффективного ингибирования ПОЛ. Антиокси­дантные свойства аскорбата основаны на функционировании одно­электронных циклических переходов между дигидро-, семидигид- ро- и дегидроаскорбатными формами. Скорость этих превращений зависит от присутствия металлов переменной валентности, других пар окислитель—восстановитель и величины pH. Способностью не­посредственно взаимодействовать с АФК характеризуется восста­новленная форма аскорбиновой кислоты.

Витамины С, A, D и F, при окислении и аутоокислении кото­рых образуются промежуточные радикальные формы, могут вы­полнять роль инициаторов окисления и ускорять ПОЛ, увеличи­вая скорость зарождения цепей реакций в мембранах. Кроме того, в присутствии ионов железа и меди аскорбиновая кислота стано­вится мощным прооксидантом, что указывает на необходимость in vivo надежной секвестрации свободных ионов металлов пере­

менной валентности. Проявление аскорбатом анти- или проок- сидантных свойств зависит также от концентрации субстрата и условий протекания окислительных реакций. Такая ее функци­ональная пластичность необходима для осуществления в биосис­темах механизма редокс-регуляции.

Антиоксидантные свойства глутатиона (GSH) — трипептида, образованного цистеином, глутаминовой кислотой и глицином, определяются как непосредственным взаимодействием с АФК и обменными реакциями с дисульфидными связями, так и функцио­нированием глутатионзависимых ферментов (см. выше). Меха­низм защитного эффекта глутатиона связан с инактивацией вы­сокореакционных кислородных и органических свободных ра­дикалов вследствие переноса атомов водорода с молекулы тиола. Образующиеся активные частицы обладают меньшим повреж­дающим эффектом по сравнению с радикалом, у которого неспа­ренный электрон локализован на атоме углерода:

Тиильные радикалы эффективно удаляются из реакционной среды вследствие образования дисульфидов глутатиона.

Глутатион необходим для нормального функционирования эритроцитов и кроветворной ткани, в норме он практически весь ассоциирован с форменными элементами крови и находится в восстановленной форме (до 96 %). GSH участвует в восстановле­нии метгемоглобина. Ферменты синтеза глутатиона находятся в эритроцитах. Процесс восстановления его происходит с участи­ем глутатионредуктазы, а также NADPH и зависит от активнос­ти пентозофосфатного пути. Клеточный глутатион участвует в поддержании пула восстановленного аскорбата: перенос восста­новленных эквивалентов с GSH на аскорбат осуществляется глу- татиондегидроаскорбатредуктазой.

Мочевая кислота по своим свойствам близка к енольным антиоксидантам и может выступать синергистом с радикалами а-токоферола и аскорбиновой кислоты. Она способна инактиви­ровать синглетный кислород, гидроксильный радикал, связывать ионы железа с участием аминогрупп, ингибировать ПОЛ и вос­станавливать метгемоглобин с образованием радикала урата.

Разные группы антиоксидантов функционируют в тесной вза­имосвязи: снижение концентрации или активности одних ком­понентов антиокислительных систем приводит к изменению уров­ня других, что обеспечивает поддержание окислительно-восста­новительного гомеостаза клеток. Антиоксидантные ферменты и низкомолекулярные соединения катализируют последовательные этапы превращения АФК, например:

Высказано представление об антиоксидантных цепях переноса электронов, эффективность функционирования которых обеспечи­вается работой всех компонентов антиокислительных систем.

Антиоксиданты, модифицируя структуру и функциональную активность мембран, оказывают воздействие на клеточный метабо­лизм различными способами: в результате взаимодействия со сво­бодными радикалами, рецепторами, путем ингибирования и акти­вирования ферментов, непосредственного встраивания в мембрану, взаимодействия с генетическим аппаратом клетки (рис. 30).

Необходимо отметить, что выяснение множественных меха­низмов действия антиоксидантов в организме, включающих и воздействие их на скорость ПОЛ, и влияние на различные про­цессы клеточного метаболизма, представляет сложную научную задачу. Это связано с проявлением ими активности в широком интервале концентраций (10~¹⁸—10~² моль/л) и реализацией в каж­дом интервале концентраций различных механизмов:

—• протеканием реакций ингибиторов со свободными ради­калами;

— взаимодействием с клеточными рецепторами;

—• изменением текучести липидов мембран и мезофазных переходов в них;

Рис. ЗО, Схема процессов регуляции клеточного метаболизма с уча­стием окислительных реакций в липидах мембран (К. Е. Круглякова, Л. Н. Шишкина, 1992)

— непосредственным влиянием на активность ферментов;

— влиянием на лиганд-белковые отношения через парамет­рический резонанс.

Переход от одного механизма к другому обусловливает слож­ную немонотонную, полимодальную зависимость "доза—эффект" (Е. Б. Бурлакова, 1998).

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Опишите основные механизмы модификации белковых и липид­ных компонентов биомембран при воздействии экстремальных факто­ров внешней среды и развитии патологических состояний организма.

2. Что такое пероксидное окисление липидов, какие факторы ини­циируют этот процесс, какова последовательность стадий его развития?

3. В чем состоит сущность цепного окисления липидов?

4. В чем разница между ферментативным и неферментативным пероксидным окислением липидов?

5. Что такое активные формы кислорода, какова их роль в развитии различных патологических состояний организма?

6. Каковы механизмы образования различных активных форм кис­лорода?

7. Опишите свойства и пути утилизации супероксидного анион-ра­дикала и пероксида водорода.

8. В чем отличие синглетного молекулярного кислорода от других активных кислородных метаболитов?

9. Какова роль NO-радикала в регулировании процессов клеточного метаболизма?

10. Что называют оксидативной модификацией макромолекул и окислительным стрессом?

11. Дайте определение понятия "антиоксиданты”.

12. Каковы основные механизмы ингибирования антиоксидантами окислительных процессов?

13. Охарактеризуйте основные компоненты системы высокомоле­кулярных антиоксидантов.

14. Какова роль глутатионзависимых ферментов в регулировании уровня свободнорадикальных продуктов ПОЛ и активных кислород­ных метаболитов?

15. В чем отличия прооксидантов от антиоксидантов?

16. Опишите свойства, механизмы действия и метаболические функ­ции основных низкомолекулярных компонентов антиоксидантной сис­темы.

17. Обоснуйте утверждение: "Биомембраны — непременные участ­ники совокупности процессов возникновения и развития ряда патоло­гических состояний организма человека".