Пути регулирования активности векторных ферментов биомембран

Одним из наиболее актуальных вопросов современной мем­бранологии является выяснение принципов и механизмов ре­гуляции векторных ферментов биомембран (в том числе Na^h, К⁺-АТФазы), выполняющих разнообразные “жизненно важные” функции не только для отдельных мембранных структур, но и для клетки в целом.

По современным представлениям, Na⁺, К⁺-АТФаза является типичным липидзависимым ферментом: для формирования его функционально-активной конформации необходимы кислые ли­пиды. Показано, что мембранные гликолипиды, локализованные преимущественно в наружной половине бислоя, обеспечивают правильную ориентацию Na⁺, К ' -АТФазнсго комплекса относи­тельно плоскости мембраны (т.е. они отвечают за проявление век­торных свойств фермента). Вместе с тем остается неясным, како­ва специфическая роль мембранных фосфолипидов в обеспече­нии транспортной функции Na⁺, К'-АТФазы. По-видимому, фун­кционирование центров связывания нуклеотидов и катионов на молекуле фермента не зависит от липидов, тогда как для осуще­ствления конформационных перестроек в ферментном белке важ­на его связь с мембранными липидами.

Получены данные, свидетельствующие о том, что липиды, создающие микроокружение Na⁺, К⁺-АТФазы в биомембранах, характеризуются сравнительно низкими энергиями взаимодей­ствия с ферментом. Существует мнение, что Na⁺, К⁺-АТФаза не имеет аннулюса в традиционном понимании этого термина. Вме­сте с тем исследования с использованием ЭПР-спектроскопии спин-меченных фосфолипидов показали, что фермент оказывает существенное влияние на фосфолипидный состав ближайшего микроокружения в мембране, преимущественно связывая отри­цательно заряженные фосфолипиды. Оказалось, что сродство Na⁺, К⁺-АТФазы к отрицательно заряженным фосфолипидам в сред­нем в 4 раза больше, чем к положительно заряженным, и я в 2,5 раза больше, чем к нейтральным. Эта избирательность фер­мента по отношению к заряду молекул фосфолипидов может быть связана с наличием положительно заряженных боковых цепей аминокислотных остатков во внутримембранном домене Na⁺, К*-АТФазы, взаимодействующем с полярными головками фосфолипидов из ближайшего микроокружения. Для ряда ин­тегральных мембранных белков обнаружены такие боковые цепи — остатки аргинина и лизина, преимущественно взаимо­действующие с отрицательно заряженными фосфолипидами би­слоя. Получены доказательства того, что изменение физического состояния липидного окружения Na*, К*-АТФазы под влиянием температуры, содержания в нем холестерина, длины цепи и сте­пени ненасыщенности жирных кислот, входящих в состав фос­фолипидов, может влиять на активность этого фермента.

I. J. De Pont et al. (1978) показали, что гидролиз различных фосфолипидов, содержащихся в высокоочищенном препарате Na⁺, К*-АТФазы из ткани почек крокодила с помощью фосфолипа­зы С, существенно не влияет на активность фермента. С другой стороны, удаление 60 % фосфолипидов из такого же препарата белка с помощью фосфолипазы А приводило к потере 70 % АТФазной активности, в то время как число уабаин-связываю- щих центров оставалось неизменным. Такой разброс данных о липидной “потребности” Na*, К⁺-АТФазы объясняется тем, что снижение ферментативной активности обусловлено не только уменьшением содержания фосфолипидов, но и ингибирующим действием жирных кислот, образующихся при гидролизе фос­фолипидов фосфолипазами.

Все вышеизложенное свидетельствует о том, что целый рад воп­росов, касающихся детального выяснения роли липидного матрик­са в функционировании мембраносвязанной Na*', К⁺-АТФазы, оста­ется недостаточно изученным.

По всей вероятности, Na* , К⁺-АТФаза находится в тесной про­странственной и функциональной взаимосвязи не только с липи­дами, но и с мембранными белками. Были получены доказатель­ства взаимодействия этого фермента с периферическим белком мембранного скелета — анкирином, установлена его связь с ани­онным переносчиком — белком полосы 3, выявлено регулятор­ное влияние на активность АТФазы спектрии-актинового комп­лекса. Имеются данные, указывающие на возможность образо­вания за счет белок-белковых взаимодействий в мембране эрит­роцитов сложных мультиферментных комплексов, состоящих из глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеиазы, фосфоглицераткиназы, фосфоглицератмутазы и Na⁺, К'-АТФазы. Между указанными фер­ментами существует функциональное сопряжение, за счет кото­рого субстраты — 1,3-дифосфоглицерат и АТФ — непосредствен­но транспортируются от одного компонента системы к другому.

Известно, что Na⁺, К⁺-АТФаза может быть функционально связана с такими мембранными системами как, Na⁺/Ca²'¹-обмен­ник, рецептор инсулина, ^-адренорецепторы, сАМР-зависимая протеинкиназа, аденилатциклаза.

Обсуждается вопрос о существовании in vivo пространствен­ной и функциональной взаимосвязи между мембраносвязанны­ми Na⁴, К⁺-АТФазой и ацетилхолинэстеразой. Субстрат ацетил- холинэстеразной реакции - ацетилхолин был одним из первых соединений, идентифицированных как нейротрансмиттеры. Он принадлежит к группе нейропередатчиков, вызывающих депо­ляризацию постсинаптических мембран, которая приводит к воз­никновению пикового потенциала и торможению активности Na⁺, К⁺-АТФазы. Действие ацетилхолина в основном устраняется пу­тем его энзиматического расщепления ацетилхолинэстеразой.

Регуляторные механизмы, в реализации которых, очевидно, участвуют вторичные мессенджеры (например, С а²⁴ и сАМР), гор­моны, биогенные амины, нейротрансмиттеры и другие факторы, наименее изучены. Однако не вызывает сомнений, что именно благодаря им происходит более тесное сопряжение натриевого насоса с важнейшими процессами клеточного метаболизма.

Существенное значение для проявления функциональной ак­тивности Na⁺, К⁺-АТФазы и других векторных ферментов (Са²⁺-АТФаза, аденилатциклаза, цитохромоксидаза), состоящих из нескольких субъединиц, имеют степень олигомеризации и коо­перативные взаимодействия субъединиц или доменов в составе олигомерных молекул, которые находятся под контролем внут­ренних и внешних факторов. Все вышеперечисленные регуля­торные звенья, а именно: взаимодействие физиологических ли­гандов со специфическими центрами связывания; индуцируемые лигандами взаимодействия доменов внутри субъединиц, отдель­ных субъединиц, протомеров, олигомерных комплексов; модуля­торные эффекты липидного матрикса — лежат в основе кратко­срочной (быстрой) или “оперативной” регуляции активности век­торных ферментов биомембран при изменении функционально­го состояния клетки. Этот механизм реализуется за счет элект­ростатических, гидрофобных, ван-дер-ваальсовых взаимодействий, водородных, ковалентных связей, участвующих в поддержании липид-белковых, белок-белковых, липид-липидных взаимодей­ствий (раздел 1.4).

“Долгосрочный” механизм регулирования активности мемб­ранных ферментов реализуется за счет белоксинтезирующей си­стемы клетки и заключается в поддержании оптимального соот­ношения между скоростью биосинтеза и распада этих фермен­тов. Он направлен на обеспечение биогенеза необходимого коли­чества функционально активных молекул и олигомерных комп­лексов векторных ферментов, приходящихся на единицу площа­ди поверхности мембраны. “Долгосрочный” механизм связан с действием различных гормонов, вторичных мессенджеров и дру­гих факторов на плазматическую мембрану клетки.

Биосинтез векторных ферментов биомембран на начальных стадиях происходит аналогично синтезу большинства белков эука­риотических клеток, однако имеет и ряд особенностей. Так, мем­бранные белки синтезируются, как правило, в виде неактивных форм (проферментов), которые с помощью селективного протео­лиза превращаются в активные формы в ходе посттрансляцион­ной модификации. Вероятно, биосинтез различных субъединиц олигомерных молекул мембранных белков происходит на раз­ных мРНК в шероховатой (гранулярной) эндоплазматической сети. Полагают, что эффективность синтеза мембранных белков значительно повышается за счет объединения отдельных рибо­сом в полисомы. Однако более детальные исследования, касаю­щиеся выявления важных аспектов биогенеза мембранных бел­ков, остаются не выясненными до настоящего времени.

“Краткосрочный” и “долгосрочный” механизмы регулирова­ния активности мембранных ферментов в реальных условиях in vivo дополняются многочисленными компонентами: функцио­нальным “сопряжением” одного фермента с другими, наличием каскадных механизмов регуляции, “модуляцией” активности белков мембран в результате воздействия физических агентов. В целом процесс регулирования функционирования векторных белков-ферментов биомембран рассматривается как сложное-вза- имодействие “подсистем” универсального регуляторного механиз­ма, обеспечивающее структурно-функциональную интеграцию компонентов мембран и поддержание клеточного гомеостаза (рис. 25). Универсальность основных регуляторных механизмов векторных ферментов биомембран обусловлена сходством их

Риє. 25. Схема процессов регуляции активности векторных фермен­тов биомембран (А. В. Кравцов, И. Р. Алексеенко, 1990)

структурной организации и трансмембранным характером вы­полняемых ими функций. Вместе с тем остается открытым воп­рос о приоритетности того или иного регуляторного механизма и об их взаимодействии в процессе функционирования каждого конкретного фермента. Таким образом, разрабатываемая в на­стоящее время концепция общности принципов регуляции ак­тивности ферментов, выполняющих трансмембранные функции, требует новых экспериментальных доказательств.

2.3.1.