Адсорбционный механизм регуляции метаболизма: понятие о метаболоне, его структура, физиологическое значение образования

В последние годы наряду с “классической” энзимологией, рас­сматривающей ферментные системы как гомогенный раствор со свободно плавающими ферментами и метаболитами, выделилось направление, основанное на пространственной и структурной орга­низации ферментных систем.

Впервые взаимодействие гликолитических ферментов со струк­турными белками мышц было описано Н. Arnold, D. Pette (1968), которые установили, что на долю F-актина приходится больше свя­занных ферментов гликолиза, чем на долю миозина, актомиозина и белков стромы. Из ферментов наибольшим сродством к F-актину обладает альдолаза, несколько меньшим — глицеральдегид-3-фос- фатдегидрогеназа. Определенную способность к взаимодействию проявляют также фрсфофруктокиназа, 3-фосфоглицераткиназа, пи- руваткиназа и лактатдегидрогеназа. F. М. Clarke, С. J. Masters (1975) изучили способность ферментов гликолиза образовывать фермен­тативно-активные комплексы с F-актином и F-актин-—тропомио- зин—тропонином из мышц быка. Они показали, что такие фермен­ты, как фосфофруктокиназа, альдолаза, пируваткиназа, лактатде­гидрогеназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, легко ассоциируют с F-актином и нативным тонким: филаментом. Причем наибольшее

сродство эти ферменты проявляют к комплексу F-актин______ тропоми-

озин*—тропонин. 1 риозофосфатизомераза, фосфоглицераткиназа, фосфоглицератмутаза, енолаза и гексокиназа связываются гораздо медленнее. Наилучшие условия ассоциации наблюдались при фи­зиологической концентрации солей - 5,0 ммоль/л КС1 и высокой концентрации миогена — 35 мг/мл.

В опытах по экстракции ферментов из грудной мышцы кури­цы также была показана специфическая адсорбция гликолити- ческих ферментов, особенно глицеральдегид-3-фосфатдегидрогена- зы и лактатдегидрогеназы (J. В. Ehmann, Н. О. Hultin, 1973; R. L. Melrdck, Н. О. Hultin, 1973). Кинетические параметры обоих ферментов при связывании изменялись: максимальная скорость и константа Михаэлиса выше для свободной глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназы; при переходе лактатдегидрогеназы в свя­занную форму предотвращается ее ингибирование пируватом.

Предположение о существовании на мембране эритроцитов структурно упорядоченного комплекса гликолитических фермен­тов было высказано еще в 1965 г. D. Е. Green et al. Позднее с использованием метода седиментации на препарате миогена было обнаружено увеличение кажущихся молекулярных масс альдола­зи, лактатдегидрогеназы, пируваткяназы и фосфофруктокиназы (F. М. Clarke, С. J. Masters, 1973), Полученные результаты подтвер­дили наличие полиферментных комплексов гликолитических ком­понентов при физиологических условиях pH и ионной силы.

На основе анализа данных по внутриклеточному распределе­нию ферментов гликолиза в мышечных клетках D. Pette (1975) пришел к заключению о существовании упорядоченного мульти­ферментного комплекса гликолитических ферментов, адсорбирован­ных на структурных белках мышц. Гистохимическими исследова­ниями подобный комплекс ферментов был выявлен в изотропной зоне миофибрилл мышечных волокон (Р. Sigel, D. Pette, 1969).

J. Mowbray, V. Moses (1976) обнаружили мультиферментный комплекс, обладающий активностями всех ферментов гликоли­за, в растворимой фракции разрушенных механическим путем сферопластов Escherichia coli. F. R. Opperdoes и P. Borst (1977) выявили, что полный набор ферментов гликолиза африканской трипаносомы Trypanosoma brucei упакован в примембранной орга­нелле, названной ими “гликосомой”.

При изучении обратимого связывания ферментов глико­лиза в скелетных мышцах было высказано предположение о том, что ассоциация — диссоциация этих ферментов с сократительным аппаратом является регулятором гликоли- тического пути (Т. Р. Walsh et al., 1981).

В ряде работ обсуждается возможный характер пространствен­ной организации комплекса ферментов гликолиза. П. Фридрих предложил гипотетическую схему расположения ферментов в мембране эритроцитов (рис. 20). Идея схемы состоит в наложе­нии последовательно расположенных ферментов центральной ча­сти гликолиза на пучок “хвостов” белка полосы 3, имеющих весьма специфичные участки для связывания каждого фермента. Схема учитывает также возможное участие белков цитоскелета (акти­на) в процессе связывания отдельных ферментов.

Б. И. Курганов и соавт. (1986, 1988) выдвинули гипотетичес­кую модель структур комплекса гликолитических ферментов в ске­летных мышцах, а также на внутренней поверхности мембраны эритроцитов. Возможность объединения гликолитических фермен­тов в комплекс предопределена тем, что их молекулы имеют цент­ры узнавания своих “соседей”, а однозначность сборки достигается тем, что в ней принимает участие якорный белок подложки, на

Рис. 20. Гипотетическая схема расположения ферментов в мембране эритроцитов (П. Фридрих, 1986). Димеры В-З-Р (белка полосы 3) — поіру- женньте в мембрану гексагональные структуры. Их N-концы формируют в липидном бислое каналы для анионов и выступают в цитоплазму. ФГК — 3-фосфоглицераткиназа; НЬ — гемоглобин; ГАФД - глицеральдегид-3- фосфатдегидрогеназа; Альд. — альдолаза; ФФК — фосфофруктокиназа

которой формируется комплекс. Комплексы отдельных гликоли­тических ферментов непрочны, что затрудняет их изучение в ра­створе. Кооперативность процесса ассоциации приводит к тому, что ассоциация должна протекать по принципу “все или ничего”. Ком­плекс гликолитических ферментов формируется на тонких нитях изотропной зоны миофибрилл мышечных волокон, образованных F-актином и регуляторными белками — тропомиозином и тропо­нином, или на димерах белка полосы 3, погруженных в мембрану эритроцитов.

Предполагают, что в скелетных мышцах гликолитическая система стимулируется ионами Са²⁺ , связывающимися с “якор­ным” белком подложки — тропонином С. Первый этап сборки комплекса — это, по всей вероятности, посадка фосфофруктоки- назы на “якорный” белок. Остов “ядра” комплекса, так называе­мое “ядрышко”, образуют в мышечной ткани, кроме фосфофрук- токиназы, альдолаза и глицеральдегидфосфатдегидрогеназа. В со­став “ядра” входят глюкозофосфатизомераза, пируваткиназа, лактатдегидрогеназа и фосфоглицераткиназа. Остальные компо­ненты комплекса (фосфоглицеромутаза, енолаза, триозофосфати- зомераза, глицерол-3-фосфатдегидрогеназа) занимают, очевидно, положения на периферии комплекса (рис. 21).

Рис. 21. Этапы сборки комплекса ферментов гликолиза: О — якор­ный белок подложки; 2 — глюкозофосфатизомераза; 3 — фосфофрук- токиназа; 4 — альдолаза; 5 — глицеральдегидфосфатдегидрогеназа; 6 — фосфоглицераткиназа; 7 — фосфоглицеромутаза; 8 — енолаза, 9 — пи- руваткиназа, 10 — лактатдегидрогеназа; 11 — триозофосфатизомераза; 12 — глицерол-3-фосфатдегидрогеназа. В скобках указано число моле­кул ферментов в состояниях I—IV комплекса

Сборка гликолитического метаболона на внутренней поверх­ности мембраны эритроцитов происходит на гексамерах (триме­рах димеров) белка полосы 3, имеющих ось симметрии третьего порядка, перпендикулярно к плоскости мембраны. Первым эта­пом сборки комплекса гликолитических ферментов является ад­сорбция б-фосфофруктокиназы (ей принадлежит ключевая роль) на олигомерах белка полосы З (Б. И. Курганов, А. Е. Любарев, 1988).

Рис. 22. Гипотетическая структура комплекса ферментов гликоли­за, формирующегося на внутренней поверхности мембраны эритроци­тов (три проекции) (Б. И. Курганов, А. Е. Любарев, 1988): Q — димер белка полосы 3; 1 — глюкозофосфатизомераза; 2 — 6-фосфофруктоки- наза; 3 — фруктозобисфосфатальдолаза; 4 — глицеральдегидфосфатде- гидрогеназа; 5 — фосфоглицераткиназа; 6 — мультифункциональный фермент, обладающий фосфоглицеромутазной, бис-фосфоглицеромутаз- ной и бис-фосфоглицератфосфатазной активностями; 7 — енолаза; 8 — пируваткиназа; 9 — лактатдегидрогеназа; 10 — триозофосфатизомера- за; 11 — глицерол-3-фосфатдегидрогеназа

партмент имеет вход(ы) для поступления исходных субстратов и выход(ы) конечных продуктов метаболического пути. “Места” выхода АТР — продукта гликолитического пути - в комплексе ферментов гликолиза находятся вблизи фосфоглицераткиназы и пируваткиназы. По-видимому, АТР, продуцируемый фосфогли- цераткиназой, утилизируется Na⁺, К⁺-АТФазой.

Таким образом, комплекс гликолитических ферментов, ад­сорбированный на димерах белка полосы 3, может находиться в контакте с Na⁺, К⁺-АТФазной системой и обеспечивать потреб­ности последней в АТР. Взаимодействия ферментов, входящих в состав мультиферментного комплекса, обеспечивают возмож­ность регулирования функциональной активности комплекса как единого целого. Роль факторов контроля отводится в дан­ном случае не интермедиатам метаболического процесса, а вне­шним факторам - вторичным посредникам, с помощью кото­рых осуществляется оптимальное функционирование мульти­ферментного комплекса в рамках системы более высокого уров­ня сложности, т.е.

Следовательно, сборка ферментов, участвующих в общем мета­болическом пути, приводит к ослаблению изостерических и алло­стерических механизмов и обеспечивает возможность реализации иерархически более “высокого” регуляторного механизма, осуще­ствляющего контроль функционирования метаболической систе­мы как целого. Этот механизм контроля реализуется с участием вторичных мессенджеров, т.е. является механизмом слежения, переключающим функционирование метаболической системы в новый режим в соответствии с сигналами, поступающими от более высоких уровней контроля метаболизма. Механизм контроля фун­кционирования мультиферментного комплекса как целого осуще­ствляется с более высокой скоростью в сравнении с изостерически- ми и аллостерическими механизмами регуляции.

Мультиферментные комплексы, формирующиеся на подлож­ках биологической природы, являются мобильными образовани­ями, которые находятся в равновесии со свободными фермента­ми. Это обстоятельство определяет возможность эффективного осуществления и взаимодействия в клетке и механизмов гомео­стаза, и механизмов слежения.

Ферменты, связанные общими метаболитами или кофермен­тами, находятся в метаболоне рядом друг с другом. Это обеспечи­вает эффективное продвижение интермедиатов по конвейеру ак­тивных центров в микрокомпартменте, образующемся при сбор­ке метаболона (Б. И. Курганов, А. Е. Любарев, 1988).

На основе данных о пространственной организации метаболи­ческих процессов в цитоплазме эукариотической клетки А. Г. Ря­занов и А. С. Спирин (1989) построили эстафетную модель работы ферментов в клетке, которая объясняет молекулярный механизм компартментализации. Модель основана на трех постулатах: ассо­циации ферментов с субклеточными структурами, передачи мета­болитов между ферментами без диффузии в растворе и десорбции ферментов с поверхностей внутриклеточных структур в процессе каждого акта катализа (рис. 23). Важным преимуществом меха­низма “эстафеты у поверхности” является то, что он приводит к

Рис. 23. Схема эстафетной передачи метаболитов между фермента­ми у поверхности внутриклеточной структуры

концентрированию и компартментализации ферментов данного метаболического пути вблизи места потребления конечного про­дукта. Те или иные модификации ферментов или поверхности, изменяющие их взаимное сродство, создают возможности нового механизма регуляции метаболических процессов за счет простран­ственного перераспределения ферментов в клетке.

Концепция метаболической регуляции посредством динами­ческой сборки и разборки ферментных комплексов обсуждается также в работе J. Ovadi (1988).

J. Batke (1989) предложена схема процессов взаимодействия между ферментами гликолиза в мышцах (рис. 24).

На основании анализа результатов исследования взаимодей­ствия ферментов цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), связанно­го со множеством анаболических и катаболических процессов, с внутренней мембраной митохондрий, а также белок-белковых вза­имодействий А. Е. Любаревым и Б. И. Кургановым (1987) раз­работана модель, описывающая пространственную структуру ком­плекса ферментов этого центрального метаболического пути. Предположение о существовании комплекса ферментов ЦТК ими было высказано с учетом следующих экспериментальных дан-

Рис. 24. Схема взаимодействия между ферментами гликолиза в мыш­цах: ФФК — фосфофруктокиназа; ФДФ — фруктозо-1,6-дифосфатаза; ГАФД — глицеральдегидфосфатдегидрогеназа; ФГК — фосфоглицерат­киназа; ПК — пируваткиназа; ЛДГ — лактатдегидрогеназа; ТФИ — три- озофосфатизомераза; ГФД — глицерол-3-фосфатдегидрогеназа; СаМ —- кальмодулин. Линиями обозначена возможность комплексирования in vitro, цифрами представлены значения K_d в микромолях

ных и теоретических расчетов: концентрация белка в матриксе митохондрий, где локализованы ферменты ЦТК, составляет 40 вес. %; в этих условиях затруднена диффузия молекул фер­ментов и их кофакторов; среднее расстояние между внутренни­ми поверхностями внутренней мембраны митохондрий сердца со­ставляет 15—30 нм.

Авторы считают, что комплекс ферментов ЦТК представляет собой гексамер из шести идентичных асимметричных субъеди­ниц, каждая из которых содержит тетрамер транссукцинилазы, по одной молекуле остальных ферментов и “якорный” белок. Ком­плекс “зажат” между противоположными поверхностями внут­ренней мембраны митохондрий, причем с мембранами контакти­руют все ферменты, за исключением а-кетоглутаратдегидроге- назы и аспартатаминотрансферазы. В качестве “якорных” бел­ков выступают интегральные белки внутренней митохондриаль­ной мембраны, в том числе сукцинатдегидрогеназа. Они обеспе­чивают сборку комплекса ферментов ЦТК на мембране, высота которого вдоль оси симметрии третьего порядка составляет 20 нм, а диаметр — 50 нм. Молекулярная масса (без учета сукцинатде- гидрогеназы) равна 8 мДа. Структура предложенной модели до­пускает возможность взаимодействия этого комплекса с другими ферментами и мультиферментными ансамблями, с которыми он связан общими метаболитами, и, прежде всего, с комплексами цепи переноса электронов внутренней мембраны митохондрий. Кроме того, метаболой ЦТК должен взаимодействовать с други­ми ферментами матрикса. Для митохондрий сердца в качестве таких белков выступают пируватдегидрогеназный комплекс и фер­менты (3-окисления жирных кислот, поставляющие в ЦТК аце- тилкофермент А.

Комплекс ферментов ЦТК — мобильная структура, находя­щаяся в равновесии со свободными ферментами матрикса. Обра­тимое равновесие между свободными и связанными ферментами контролируется целым рядом факторов: концентрациями опре­деленных метаболитов в матриксе митохондрий (цитрата, окса- лоацетата, кофермента А, ацетилкофермента A, Mg²⁺-ATP и др.), концентрацией белка, энергетическим состоянием митохондрий. Взаимодействия ферментов, входящих в состав метабол она ЦТК, обеспечивают функционирование этого надмолекулярного комп­лекса ферментов как целостной, кооперативно действующей сис­темы.

В то же время нет убедительных доказательств существова­ния надмолекулярного комплекса какого-либо метаболического пути или его фрагмента. Прямым подтверждением существова­ния метаболона (надмолекулярного комплекса ферментов, ката­лизирующих последовательные стадии ферментной системы) мо­жет быть либо его выделение, либо реконструкция in vitro и эк­спериментальное доказательство туннелирования между фермен­тами-соседями (Г. Л. Ермаков, 1993). Такие попытки предприни­маются, например, для ферментов гликолиза, цикла Кребса и цикла мочевины.

Таким образом, в настоящее время широко обсуждается про­блема пространственно-структурной организации ферментных систем. Вместе с тем отсутствуют исчерпывающие данные, каса­ющиеся изучения фермент-ферментных, фермент-мембранных взаимодействий, взаимосвязи физико-химических характеристик белков с их способностью образовывать надмолекулярные ком­плексы, выяснения роли цитоскелета клетки в организации кле­точного метаболизма. Кроме того, схемы надмолекулярной орга­низации компонентов метаболических систем требуют экспери­ментальных доказательств.

2.3.3.