6.8. ИЗУЧЕНИЕ УЧАСТИЯ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ПРОЦЕССАХ УФ-МОДИФИКАЦИИ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ

Для выявления участия активных форм кислорода в про­цессах фотомодификации белковых молекул проводят модель­ные эксперименты с использованием растворов биополимеров (в частности, лактатдегидрогеназы), а также акцепторов и тушите­лей активных кислородных метаболитов.

Одним из распространенных тушителей синглетного молеку­лярного кислорода является азид натрия NaN₃. Это соединение обладает широким спектром действия, что обусловлено элект­ронной конфигурацией его молекул. Группа — N₃ линейна:

Ее строение представляет собой суперпозицию трех резонан­сных структур с частичными зарядами у различных атомов азо­та. Вероятно, это способствует взаимодействию иона азида с ком­плементарными участками аминокислотных остатков белковой глобулы. Азид натрия используется как эффективный ионофор, его органические производные применяют в химической энзи- мологии в качестве фотореактивируемых поперечносшиваюгцих агентов.

D-маннит — широко распространенное в природе вещество — обладает сродством к ОН-радикалам. Кроме того, его фотопро- текторное действие может быть связано с образованием комп­лекса белок—спирт, более резистентного, чем свободный биопо­лимер.

Серотонин (5-гидрокситриптамин) является биологически ак­тивным веществом из группы индолилалкиламинов:

Он принимает участие в различных физиологических про­цессах. Его рассматривают как химический медиатор нервных возбуждений, антидиуретический гормон, гемостатический агент, фактор роста, медиатор аллергических реакций и др. Установле­но, что серотонин проявляет выраженный фотопротекторный эф­фект по отношению к молекулам гемопротеидов (феррицитох- рома С, каталазы и оксигемоглобина).

Лактатдегидрогеназа — гликолитический фермент, катали­зирующий обратимую реакцию окисления молочной кислоты с образованием пировиноградной кислоты в присутствии кофер­мента NAD (см. раздел 4.3).

ЛДГ обнаруживается во всех клетках и биологических жид­костях. Следует обратить внимание на тот факт, что уровень фер­мента в эритроцитах в 100 раз выше, чем в сыворотке. Поэтому при определении его активности в сыворотке крови гемолиз эрит­роцитов должен быть полностью исключен. Также необходимо быстро отделять сгусток от сыворотки. Активность ЛДГ могут подавлять гепарин и оксалат.

Повышение активности ЛДГ имеет место при некрозе тка­ней, особенно при остром поражении сердца, повреждении эрит­роцитов, почек, скелетных мышц, печени, легких и кожи. Значи­тельное увеличение активности фермента сопровождает гемоли­тические анемии, связанные с дефицитом витамина В₁₂ и фолие­вой кислоты, а также эритремию. Возрастание уровня ЛДГ ха­рактерно для острой фазы инфекционного гепатита.

Определение изоферментного спектра ЛДГ также использу­ют в диагностических целях. Изоферменты сывороточной ЛДГ выявляются после электрофореза при pH 8,6 на крахмальном, агаровом или полиакриламидном гелях. При инфаркте миокар­да обнаруживается увеличение содержания ЛДГ 1. Относитель­ное повышение уровня ЛДГ 4 и 5 наблюдается при остром гепа­тите, тяжелом мышечном повреждении, дерматомиозите, мышеч­ной дистрофии.

Лабораторная работа № 18

Исследование каталитической активности лактатдегидроге­назы спектрофотометрическим методом

Принцип метода. В основе данного определения функциональ­ной активности ЛДГ лежит метод Берг-Мейера, сущность кото­рого заключается в оценке скорости окисления NADH, регистри­руемой спектрофотометрически при длине волны 340 нм.

Материалы и оборудование: 0,1 моль/л Na-фосфатный бу­фер (pH 7,4), пируват натрия, буферный раствор лактатдегидро­геназы из сердца свиньи или скелетных мышц свиньи, спектро­фотометр СФ-46, кварцевые кюветы, стеклянные пипетки и про­бирки, фильтровальная бумага, секундомер.

Ход работы

Если в работе используется коммерческий препарат ЛДГ из мышц свиньи (кристаллическая суспензия в 2,2 моль/л сульфа­те аммония), то он должен быть предварительно обессолен мето­дом гель-хроматографии на колонке (15x1,5 см), упакованной сефадексом G-25. Выделение ЛДГ из сердца свиньи проводят по методике, описанной в лабораторной работе № 17.

Концентрацию растворов фермента определяют на спектро­фотометре СФ-46 при длине волны 280 нм с использованием коэффициента молярной экстинкции 1,96-10⁶ л (моль^-1 • см'¹) для мышечной и 0,196‘10^Б л (моль^-1 -см'¹) для сердечной изоформы.

Реактивы (указаны конечные концентрации)

а) для ЛДГ из мышц свиньи:

1. Na-фосфатный буфер — 0,1 моль/л (pH 7,4).

2. ЛДГ (буферный раствор) — 10^-8 моль/л.

3. Пируват натрия (буферный раствор) — 1,5-10"³ моль/л.

4. NADH (буферный раствор — 5,4-Ю'⁶ моль/л.

б) для ЛДГ из сердца свиньи:

1. Na-фосфатный буфер — 0,1 моль/л (pH 7,4).

2. ЛДГ (буферный раствор) — 10^-8 моль/л.

3. Пируват натрия (буферный раствор) — 0,15*10“³ моль/л.

4. NADH (буферный раствор — 5,4-10~^Б моль/л.

В кварцевую кювету для спектрофотометра поместить 2,8 мл раствора фермента и 0,1 мл NADH. На спектрофотометре СФ-46 при длине волны 340 нм измерить оптическую плотность D_r Затем в кювету прилить 0,1 мл пирувата натрия и через 30 с зарегистрировать оптическую плотность D₂. Каталитическую ак­тивность ЛДГ (А) рассчитывают по формуле

д_Д^340 ' V_lip Є • Ї • t

где AD₃₄₀ = Dj - D₂ — изменение величины оптической плотности реакционной смеси при 340 нм; є — молярный коэффициент по­глощающего соединения (NADH), равный 6,22-10³ л (моль^-1 • см^-1); I — длина оптического пути (1 см); t — время инкубации реакци­онной смеси (30 с); V_np — конечный объем реакционной смеси (3 мл).

Лабораторная работа № 19

Выделение лактатдегидрогеназы из сердца свиньи

Материалы и оборудование; 0,2 моль/л Na-фосфатный бу­фер (pH 7,2), 0,1 моль/л Na-фосфатный буфер (pH 7,2), 0,1 моль/л Na-фосфатный буфер (pH 7,5), сульфат аммония мелкоизмель- ченный, сульфат аммония (0,5 насыщения), ацетон, хлорид на- трия’(лед), хлорид кальция, концентрированный раствор аммиа­ка, гомогенизатор (“Homogenizer type 302”, Польша), магнитная мешалка, центрифуга MPW-360, центрифужные пробирки, стек­лянная посуда, фильтровальная бумага.

Ход работы

Для приготовления кальций-фосфатного геля к 0,5 л 0,44 моль/л Na₂HPO₄ при энергичном перемешивании быстро до­бавить 0,5 л 0,66 моль/л СаС1₂. Концентрированным раствором аммиака довести pH раствора до значений 8,2—8,6. Полученную суспензию поместить в стеклянный цилиндр объемом 2 л, на­лить бидистиллированную воду и перемешать. После оседания геля жидкость декантировать. Оставшуюся суспензию вновь за­лить водой, перемешать и отстаивать. Аналогичную процедуру повторять до тех пор, пока в промывных водах не исчезнут ионы хлора. После этого общий объем суспензии довести водой до 1 л. Гель надо готовить за 1—-2 дня до использования и хранить в холодильнике.

Все работы с растворами фермента необходимо проводить на ледяной бане и в холодной комнате.

Экстракция. Охлажденные свиные сердца освободить от жиро­вой и соединительной ткани и гомогенизировать при 10000 об/мин (“Homogenizer type 302”, Польша). Около 400 г измельченной тка­ни залить 1,5 л холодной бидистиллированной воды, перемешать в течение 20 мин при помощи магнитной мешалки, отжать через несколько слоев марли я фильтровать для удаления жира через стеклянную вату.

Обработка калъций-фосфатным. гелем. К экстракту при пе­ремешивании добавить 0,3 л суспензии кальций-фосфатного геля. Перемешивание продолжать еще 5 мин и затем отстаивать. Че­рез 30 мин прозрачную жидкость над осадком просифонировать и отбросить, а оставшуюся суспензию центрифугировать 15 мин при 2000 g на рефрижераторной центрифуге MPW-360 (Польша).

К осадку добавить 0,2 л 0,2 моль/л фосфатного буфера с pH 7,2, перемешать до получения однородной суспензии и центрифуги­ровать 15 мин при'2000 g. Надосадочную жидкость слить, а к осадку добавить 0,15 л 0,2 моль/л фосфатного буфера (pH 7,2). Тщательно перемешать и центрифугировать 15 мин при 2000 g.

Первое осаждение сульфатом аммония. К объединенным цен- трифугатам, полученным на предыдущей стадии, при перемеши­вании отдельными порциями добавить сульфат аммония до 0,6 насыщения. Перемешивать еще 15 мин, затем центрифугировать при 2600 g в течение 30 мин.

Первое осаждение ацетоном. Осадок растворить в 40 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера с pH 7,2 и к полученному раство­ру добавить' предварительно охлажденный до -15 °С ацетон в количестве 60,4 мл на каждые 100 мл ферментативного раство­ра. Поднять температуру до 13 °С и инкубировать смесь 10 мин, затем центрифугировать при 2600 g в течение 15 мин. К осадку добавить 20 мл сульфата аммония 0,3 насыщения. Перемешать до получения однородной суспензии и через 30 мин центрифуги­ровать 40 мин при 2600 g.

Второе осаждение сульфатом аммония. К центрифугату до­бавить сульфат аммония до 0,5 насыщения. Перемешать в тече­ние 10 мин и оставить в холодильнике на 6—8 ч. Центрифугиро­вать 40 мин при 2600 g и осадок растворить в 5,5 мл холодной бидистиллированной воды.

Второе осаждение ацетоном. К ферментному раствору, как и в первый раз, добавить ацетон, охлажденный до -15 °С. Темпе­ратуру поднять до 18 °С, выдержать 10 мин, затем центрифуги­ровать 15 мин при 2600 g. Осадок суспендировать в 2 мл сульфа­та аммония 0,3 насыщения.

Кристаллизация. К ферментному раствору присыпать суль­фат аммония до 0,5 насыщения. Перемешать и оставить в холо­дильнике на ночь. Центрифугировать 20 мин при 2600 g и оса­док растворить в сульфате аммония 0,3 насыщения. К суспензии добавить сульфат аммония до 0,5 насыщения. Описанную проце­дуру повторить три раза. Суспензию кристаллов фермента хра­нить в холодильнике.

В процессе выделения ЛДГ содержание белка на различных стадиях необходимо контролировать по методу Лоури (см.

Степень гомогенности полученного препарата анализируют методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле (см. ла­бораторную работу № 20).

Лабораторная работа № 20

Исследование изоферментного спектра лактатдегидрогена­зы методом электрофореза в полиакриламидном геле Определение изоферментов ЛДГ методом диск-электрофоре­

за в полиакриламидном геле основано на различиях в зарядо­вом состоянии и электрофоретической подвижности молекул разных изоформ белка.

Материалы, и оборудование', соляная кислота, трисгидрокси- метиламинометан (трис), ТЕМЕД, акриламид, бисакриламид (БИС), персульфат аммония, рибофлавин, сахароза, бромфеноловый си­ний, феназинметасульфат, нитросиний тетразолиевый, хлорид магния, хлорид натрия, фосфатный буфер (pH 7,4), NADH, лак­тат натрия, уксусная кислота, парафин, установка для диск-элек­трофореза, термостат, денситометр, ртутно-кварцевая лампа.

Ход работы

Для получения мелкопористого (5,5 %) геля, в котором осу­ществляется разделение веществ в соответствии с их зарядом и молекулярной массой, необходимо смешать 1 объем раствора А (48 мл 1 н НС1, 36,6 г трис и 0,23 мл ТЕМЕД на 100 мл бидистил­лированной воды), 2 объема В_щ (28 г акриламида и 0,735 г БИС в 100 мл дистиллированной воды), 4 объема раствора 2_щ (0,14 %-ный раствор персульфата аммония) и добавить 1 объем дистиллиро­ванной воды. Осторожно перемешав стеклянной палочкой полу­ченную смесь, внести но 2 мл ее в каждую трубку (один конец трубки заклеить и загерметизировать расплавленным парафи­ном). Для предотвращения ингибирования молекулярным кис­лородом процесса полимеризации геля и формирования ровной поверхности последнего сверху раствора наслоить бидистилли­рованную воду на высоту 5—7 мм. Процесс полимеризации за­канчивается через 30—40 мин, о чем свидетельствует появление четкой границы раздела между гелем и водой и легкое нагрева­ние трубок.

На слой разделяющего геля нанести 0,2 мл концентрирую­щего крупнопористого геля (7 %), который готовят смешивани­ем 1 объема Б_щ (24 мл 1 н НС1, 2,99 г трис и 0,23 мл ТЕМЕД на

50 мл бидистиллированной воды), 2 объемов раствора Г_щ (5 г ак­риламида и 1,25 г БИС в 50 мл воды), 1 объема Д_щ (0,004 %-ный раствор рибофлавина) и 4 объемов раствора Б_щ (40 %-ный ра­створ сахарозы). Полимеризация протекает за 10—15 мин в ус­ловиях облучения светом ртутно-кварцевой лампы. Для исклю­чения контакта с кислородом воздуха на гель также аккуратно наслоить воду на высоту 3—5 мм.

С поверхности заполимеризовавшегося концентрирующего геля удалить воду и внести образец (смесь изоферментов ЛДГ, разведенную 40 %-ным раствором сахарозы в отношении 1:1) в количестве 0,2 мл. Наслоить раствор лидирующего красителя (0,001 %-ный раствор бромфенолового синего). Эта часть колон­ки непосредственно соприкасается с электродным буфером при электрофорезе, поэтому верхнее наслаивание заканчивается элек­тродным буфером. Наслаивание проводят очень осторожно, из­бегая перемешивания образца с буфером, во избежание потери вещества.

Состав электродного буфера (pH 8,3): 6 г трис и 28,8 г глици­на на 1 л бидистиллированной воды. Перед использованием его необходимо разбавить в 10 раз.

Собрать прибор для диск-электрофореза, поместить его в хо­лодильник и подсоединить к соответствующим полюсам выпря­мителя тока. Первые 15—20 мин электрофореза сила тока не должна превышать 0,002 А на каждую трубочку. Такая низкая величина тормозит движение мелких частиц образца в раствор верхнего сосуда. По истечении этого срока силу тока увеличить до 0,004—0,005 А на гель.

После окончания электрофореза извлеченные столбики по­местить в красящую смесь для проявления изоферментов ЛДГ.

В основе тетразолиевого метода выявления локализации ферментов в гелях лежит образование нерастворимых хромо­генных веществ — формазанов. Схематически их образование может быть представлено последовательностью реакций:

NADH + феназинметасульфат (ФМС) —> ФМС _вмст

ФМС _восст + нитросиний тетразолиевый (НСТ) —)

—> НСТ_ппсст (диформазан, окрашенный продукт)

ФМС выступает в качестве переносчика электронов в цепи реакций.

В состав инкубационной среды входят 8 мл 1 моль/л раство­ра лактата натрия, 4 мл раствора NADH (10 мг/мл), 8 мл 0,1 моль/л раствора NaCl, 8 мл 0,005 моль/л раствора MgCl₂, 10 мл 0,05 моль/л фосфатного буфера (pH 7,4), 2 мл раствора ФМС (1 мг/мл) и 20 мл НСТ (1 мг/мл).

Каждый столбик ПААГ поместить в отдельную пробирку, за­лить инкубационной смесью и поставить в термостат при темпе­ратуре 37 °С на 1—1,5 ч (или инкубировать при комнатной тем­пературе в течение ночи). По истечении срока инкубации гели ополоснуть водой и перенести в пробирки, содержащие раствор уксусной кислоты (7 %). При температуре 5 °С и в темноте диск- электрофореграммы изоэнзимов ЛДГ могут сохраняться не более 7 дней. В течение этого срока их денситометрируют, изобража­ют графически изоферментный спектр ЛДГ (по оси абсцисс — длина столбика геля, по оси ординат — оптическая плотность), затем определяют содержание каждого изофермента весовым методом.

Лабораторная работа № 21

Исследование УФ-чувствительиости лактатдегидрогеназы в присутствии некоторых модифицирующих агентов Материалы и оборудование: 0,1 моль/л Na-фосфатный бу­

фер (pH 7,4), пируват натрия, NADH, буферный раствор лактат­дегидрогеназы из сердца свиньи или скелетных мышц свиньи, спектрофотометр СФ-46, кварцевые кюветы, стеклянные пипет­ки и пробирки, фильтровальная бумага, секундомер, установка для УФ-облучения биосистем.

Ход работы I вариант

Объектом исследования является готовый препарат фермен­та, обессоленный путем гель-хроматографии на сефадексе G-25 (см. лабораторную работу № 18). Преподаватель выбирает один из вариантов эксперимента. В качестве модифицирующего аген­та используется раствор:

а) азида натрия (3,2-10“³ моль/л);

б) D-маннита (5,5-Ю*⁵ моль/л);

в) серотонина (1-10'⁵ моль/л).

Затем необходимо провести определение функциональной ак­тивности:

1) нативного фермента (см. лабораторную работу № 18);

2) УФ-облученного в дозе 3,02 кДж/м² свободного фермента;

3) фермента в присутствии модифицирующего агента;

4) фермента, УФ-облученного в той же дозе в присутствии модификатора.

УФ-облучение образцов проводить согласно методике, опи­санной в лабораторной работе № 5. Данные представить в виде табл. 21.

Таблица 21

УФ-индуцированные изменения ферментативной, активности лактатдегидрогеназы в присутствии модифицирующего агента

На основании полученных результатов сделать заключение о причинах и характере изменений величин ферментативной ак­тивности ЛДГ при УФ-облучении белка в свободном состоянии и в присутствии модификатора. Какое действие может оказы­вать модифицирующий агент (азид натрия, D-маннит, серотонин) на структурно-функциональное состояние белковой молекулы при УФ-облучении растворов исследуемого фермента?

II вариант

В качестве объекта исследования используют препарат фер­мента, полученный из сердечной мышцы свиньи по методике, описанной в лабораторной работе № 17.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Опишите методику выделения эритроцитарных мембран из кро­ви доноров.

2. Какие химические реакции лежат в основе определения содер­жания белка в мембранных структурах по методу Лоури?

3. Какие принципы лежат в основе определения ферментативной активности мембраносвязанных ацетилхолинэстеразы и Na⁴, К⁺-АТФа- зы?

4. Что представляют собой флуоресцентные зонды? Назовите пара­метры, используемые для характеристики флуоресцентных зондов.

5. Каковы направления использования флуоресцентных зондов в мембранологии?

6. Что представляет собой спектр люминесценции вещества?

7. Почему люминесцентные свойства флуоресцентных зондов изме­няются при связывании их с различными мембранными структурами?

8. Опишите физико-химические методы модификации биомембран.

9. Почему фосфолипазы относят к химическим модификаторам био­мембран?

10. На каком основании каталазу относят к антиоксидантным фер­ментам?

11. Какие функции в клетке выполняет глутатионредуктаза?

12. Какие методы используют для обнаружения и доказательства фактов участия активных форм кислорода в УФ-превращениях био­макромолекул? Каковы их преимущества и недостатки?