ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА В ПРОЦЕССАХ УФ-МОДИФИКАЦИИ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ[4]

В настоящее время возрос интерес исследователей к проблеме окислительного стресса. Ключевую роль в развитии окислитель­ного повреждения играют активные формы кислорода (АФК): синглетный молекулярный кислород Ю.,, супероксидный анион- радикал, пероксид водорода Н₂О₂, гидроксильный радикал ОН’, пергидроксильный радикал, гипогалоиды (см.

Существенную роль в процессах темнового и фотоокисления биологических структур играют синглетный кислород и ради­кал гидроксила, обладающие наибольшим модифицирующим эф­фектом. Одним из широко используемых методов исследования роли тех или иных активных интермедиатов в процессе УФ-мо- дификации белка является элиминирование их при помощи спе­цифических акцепторов и тушителей.

Рассмотрим более подробно результаты исследования фото­индуцированных изменений структурно-функциональных свойств изоферментов лактатдегидрогеназы из различных источников в интактном состоянии и в присутствии ряда химических соеди­нений, способных взаимодействовать с активными формами кис­лорода.

Каталитическая активность растворов изофермента М₄ ЛДГ (0,2-Ю’⁸ моль/л) из скелетных мыщц свиньи при действии УФ- света (240—390 нм) в дозах 0,15—4,53 кДж/м² снижается с рос­том дозы облучения (В.

хов, М. А. Наквасина, 1991). NADH (2,4-10 ~⁷ моль/л) оказывает фотосенсибилизирующее действие по отношению к молекулам фермента при УФ-облучении их смеси. Падение каталитической активности ЛДГ происходит под влиянием УФ-излучения, по­глощаемого как апоферментом (А. < 280 нм), так и коферментом (Х> 260 нм). По-видимому, в процесс фотоинактивации ЛДГ вно­сят вклад преимущественно фотохимические превращения апо- белка, связанные с поглощением энергии УФ-света остатками аро­матических (триптофана, тирозина — входит в активный центр ЛДГ, фенилаланина) и серосодержащих аминокислот белка. При­сутствие указанных аминокислотных остатков в молекуле мы­шечной изоформы фермента было продемонстрировано при иссле­довании ее аминокислотного состава (табл. 14).

Содержание отдельных аминокислот в молекуле лактатдегидрогеназы

Таблица 14

Наблюдаемые при воздействии УФ-света нарушения струк­турного состояния и функциональной ■активности ЛДГ являются результатом разворачивания белковой глобулы, что находит от­ражение в изменении оптических и гель-хроматографических свойств УФ-облученного фермента.

Продуктом фотодеградации остатков триптофана являют­ся кинуренины и формилкинуренины. Показано, что произ­водные триптофана способны выполнять функцию фотодина­мических сенсибилизаторов, в частности, генерировать синг­летный кислород. В качестве источника *О₂ рассматривают процессы тушения кислородом триплетных состояний арома­тических или карбонильных соединений, которые входят в состав макромолекул или присутствуют в них в виде приме­сей. На потенциальную возможность генерации ’О, в реакции триплетных возбужденных состояний белков указывает И. И. Сапежинский (1979). Образование синглетного кислорода может происходить в короткоживущих комплексах с перено­сом заряда: ароматический углеводород (аминокислотный ос­таток) — кислород.

С целью получения дополнительной информации о механиз­ме фотопревращений ЛДГ необходимо исследовать УФ-индуци- рованные изменения структурно-функциональных свойств и ки­нетики фотоинактивации различных изофермептов ЛДГ в ши­роком спектральном диапазоне УФ-излучения для выяснения возможного участия модифицированных триптофаиилов в каче­стве «внутримолекулярных аутосеисибилизаторов». Для изуче­ния роли активных кислородных метаболитов в процессах УФ- превращений белка используют их специфические акцепторы и тушители: азид натрия, D-маннит, (3-каротин, гистидин, серото­нин. Применяемые концентрации вышеназванных соединений не должны оказывать заметного влияния на уровень активности нативного фермента.

Распространенным тушителем синглетного кислорода явля­ется азид натрия, защитное действие которого было продемонст­рировано по отношению к сенсибилизированному окислению раз­личных органических субстратов. Константа скорости его реак­ции с ‘О_а — 2-Ю⁸ л-(моль-с)"¹, 2-10® л-(моль-с)"¹. Азид натрия ту­шит триплетные состояния возбужденных молекул, но констан­та скорости данной реакции в последнем случае на 2 порядка ниже. Для подбора концентрации NaN₃ можно использовать пред­положение о простом конкурентном перехвате синглетного кис­лорода в исследуемой модельной системе и в соответствии с изве­стными'константами скорости взаимодействия 'О, с компонента­ми этой системы.

где G —' источник, генерирующий *О₂; k_d — константа дезактива­ции ‘О₂ растворителем; k_r — константа скорости реакции ¹О₂ с акцептором (окисляемым веществом); к — константа скорости тушения (или химического взаимодействия) с потенциальным протектором,

В присутствии двух конкурирующих за *О₂ соединений (А и Q) квантовый выход окисления акцептора определяется по урав­нению

Величина второго слагаемого в правой части неравенства бу­дет пренебрижимо мала по сравнению с первым до значений кон­центраций фермента -10“° моль/л. Следовательно, в этом случае

Рис. 54. Изменение фоточувствительности ЛДГ в присутствии азида натрия (я), p-каротина и D-маннита (5), гистидина (я). По оси абсцисс — концентрации модификаторов, моль/л; по оси ординат — ферментатив­ная активность, % . — активность нативного фермента, А₂ — УФ-облу-

ченного фермента. Концентрации модификаторов: а) 1 — 6,6-10'“ моль/л; 2 —• 6,6-Ю"⁴ моль/л; 3 — 3,2-10'³ моль/л; б) 1 — 3,3-10'“ моль/л (Р-каротин); 2 — 5,5-Ю’⁵ моль/л (D-маннит); 3 — Р-каротин + D-малнит; в) 1 — 1,3-10"³ моль/л; 2 — 1,3-10'² моль/л; 3 — 3.3-10'² моль/л

концентрация азида натрия для проявления фотопротекторного эффекта должна превышать 1,6-1О'³⁽~⁴⁾ моль/л.

Эти теоретические расчеты были подтверждены результа­тами экспериментов по изучению УФ-чувствительности (доза облучения — 2,27 кДж/м²) изофермента М₄ ЛДГ (2-Ю'⁸ моль/л) в присутствии азида натрия в концентрациях 6,6-Ю'⁵; 6,6-Ю'⁴; 3,2-Ю"³ моль/л (рис. 54,я). Из анализа рисунка следует, что NaN₃ в концентрации 3,2-10"³ моль/л практически полностью восстанавливает ферментативную активность исследуемого бел­ка. При изучении спектрально-люминесцентных характерис­тик ЛДГ (1О'° моль/л) после ее облучения в свободном состо­янии и в присутствии азида натрия (3,2-10~³ моль/л) выявле­но, что воздействие УФ-света на смесь фермент-азид натрия приводит к восстановлению до уровня контрольного образца величин интенсивности люминесценции модифицированного белка в его максимуме (340 нм) и светопоглощения в миниму­ме (250 нм) и в более длинноволновой области (>290 нм), что связано, вероятно, с защитой хромофорных групп ЛДГ от дей­ствия УФ-излучения.

На рис. 55, а показаны кривые зависимости остаточной ферментативной активности мышечной изоформы ЛДГ от вре­мени облучения. Для количественного описания данного процес-

Рис. 55. Кинетические кривые фотоинактивации лактатдегидроге­назы из мышц (а) и сердца {5} свиньи в присутствии некоторых фото- протекторов: а) 1 — нативная ЛДГ; ЛДГ, УФ-облученняя в присутствии модификаторов: 2 — азида натрия (3,2-lQ"^s моль/л); 3 — D-маннита (5,5-10‘^s моль/л); 4 — серотонина (1-Ю'⁵ моль/л); б) 1 — нативная ЛДГ; 2 — ЛДГ, УФ-облучеиная в присутствии азида натрия (3,2-10*³ моль/л)

са мы использовали константы фотоинактивации (k_f), рассчитан­ные по тангенсу угла наклона линейной анаморфозы исходной кривой «доза — эффект» в координатах [ln(A/A₀); t]. Для натив­ной ЛДГ k_f оказалась равной 5,39-Ю"⁴ с^-1.

Добавление азида натрия (3,2-10‘³ моль/л) при облучении раст­вора изоформы М₄ ЛДГ (2-Ю^-8 моль/л) вызывает частичное восстановление каталитической активности фермента. Однако

дозовая зависимость описывается прямой, а в полулогарифми­ческих координатах — квадратичной функцией (см. рис.55, а). Это свидетельствует о постоянстве скорости инактивации ЛДГ в изучаемом диапазоне. Таким образом, протекторный эффект NaN₃ на разных стадиях фотомодификации фермента неодина­ков. Защитное действие азида натрия может быть обусловлено тушением ‘Og, а также его комплексированием с белковой макромолекулой и, возможно, образованием внутримолекуляр­ных сшивок некоторых функциональных групп ЛДГ, что индуци­рует повышение фоторезистентности зафиксированной конформа­ции биополимера. Не исключено также тушение азидом натрия возбужденных состояний белка и его взаимодействие со свобод­ными радикалами, образующимися в процессе УФ-модификации молекул фермента.

На рис. 55, б представлена зависимость «доза — эффект» для изоформы ЛДГ из сердца свиньи в полулогарифмических координатах. Эта зависимость удовлетворительно описывается прямой. Константа скорости инактивации фермента составляет 1,41-lG"⁴ с"¹ и t_1/2=1690 с = 28 мин, что позволяет сделать вывод о меньшей фоточувствительности изофермента Н₄ по сравне­нию с М₄. При добавлении к раствору ЛДГ до облучения азида натрия остаточная ферментативная активность оказалась выше таковой для облученной в соответствующих дозах свободной изоформы (см. рис. 55, б).

Рис. 56. Сравнение протекторно­го эффекта азида натрия по отноше­нию к сердечной и мышечной изо­формам ЛДГ при различных дозах УФ-облучения: 1 — протекторный эффект NaN₃ для мышечной изофор­мы; 2 — для сердечной изоформы. По оси ординат отложена разность между уровнями ферментативной ак­тивности ЛДГ, УФ-облученной в сме­си с азидом натрия (А_х) и в свобод­ной форме (А₂)

На рис, 56 представлена зависимость протекторного эффекта азида натрия от дозы УФ-облучения по отношению к мышечной и сердечной изоформам ЛДГ. Анализ полученных данных по­зволяет сделать заключение о неоднонаправленном характере дей­ствия модификатора: максимальное защитное действие азида на­трия наблюдается для ЛДГ (М₍) при дозах облучения 3,02—6,04 кДж/м², а по отношению к ЛДГ (Н₄) — 6,04—9,06 кДж/м². Если предположить, что основной вклад в фотопротекторный эффект NaN₃ вносит процесс тушения ‘О,,, то этот активный интермедиат оказывает влияние на изменение ферментативной активности изо­форм ЛДГ при вышеуказанных дозах облучения.

Наиболее широко распространено представление о том, что дезак­тивация ’О₂ p-каротином, взаимодействующим с ним преимуще­ственно по физическому механизму, связана с переносом энергии от синглетного кислорода на низколежащий триплетный уровень каротина. Обсуждается вопрос о вкладе в рассматриваемый процесс комплекса с переносом заряда между ¹О₂ и каротином. Константа скорости дезактивации синглетного кислорода близка к диффузи­онной и составляет для СС1₍ 7-Ю⁹ л-(моль-с)'¹. Гистидин относят к типу акцепторов его дезактивация осуществляется химичес­ким путем. Константа скорости к для этой аминокислоты состав­ляет 5-Ю⁷ л-(моль-с)^-1 в метаноле; в D₂O — 10⁸ л-(моль-с)”¹. В реак­цию с *О₂ вступает только непротонированная форма гистидина. Из анализа рис. 54, б следует, что Р-каротин в концентрации 3,3-10~⁶ моль/л оказывает защитное действие по отношению к молекулам ЛДГ (М₄): активность УФ-облученного в дозе 2,27 кДж/м² белка восстанавливается на 18 % по сравнению с таковой в отсутствие протектора. Гистидин в концентраций З.ЗПО'² моль/л снижает степень инактивации ЛДГ на 19 % (см. рис, 54, в), что согласуется с данными, полученными при исполь­зовании р-каротина.

Облучение ЛДГ в присутствии D-маннита, являющегося ак­цептором ОН-радикалов, сопровождается снижением ее фото­чувствительности: константа инактивации составила 4,0-10 '¹ с ¹, a t_1/2 = 1732 с = 29 мин (рис. 55, а), Дозовая кривая имеет экспо­ненциальный характер. При изучении сочетанного воздействия Р-каротина и D-маннита на уровень активности УФ-облученной ЛДГ выявлен четко выраженный эффект аддитивности действия этих агентов (рис. 54, в). Полученные результаты свидетельству­ют о том, что их протекторное действие связано с реализацией различных каналов защиты белка от УФ-повреждения: элими­нированием Ю₂ и ОН-радикалов.

При УФ-облучении ЛДГ (МД из скелетных мышц свиньи в присутствии серотонина установлено его фотопротекторное дей­ствие по отношению к молекулам этой изоформы: k_f =3,5-10“⁴ с^-1 и t = 1980 с = 33 мин (см. рис. 55, а).

На рис. 57 показаны фотоиндуцированные изменения функ­циональных свойств ЛДГ (изоферменты Н₄, Н₃М, Н₂М₂) эритро­цитов крови человека после УФ-облучения в присутствии серо­тонина. Введение в облучаемую систему экзогенного агента в кон­центрации 10~⁸ моль/л приводит к проявлению его защитного действия только при использовании максимальной дозы УФ-све­та (4,53 кДж/м²), вызывающей наиболее глубокие изменения в структуре молекулы фермента и приводящей к падению его ак­тивности на 35 % по сравнению с контрольным образцом. Уве­личение концентрации серотонина до 10~⁷ моль/л индуцирует резкое усиление его фотопротекторного эффекта, наиболее ярко проявляющегося при облучении ЛДГ в дозах 1,51 и 4,53 кДж/м². При использовании биогенного амина в концентрации 10~° моль/л отмечается снижение его защитного действия при воздействии УФ-излучения в дозах 1,51 и 4,53 кДж/м² по отношению к это­му показателю при концентрации серотонина 10^-7 моль/л. Про­текторный эффект 5-окситриптамина может быть связан либо с акцепцией различных активных интермедиатов, в том числе и ^2, либо с образованием комплекса фермент — биогенный амин, более фоторезистентного, чем свободный белок.

Рис, 57. Зависимость уров­ня каталитической активности лактатдегидрогеназы эритроци­тов человека в свободном состо­янии и в присутствии серотони­на от дозы УФ-облучения: 1 — УФ-облучение без модификато­ра; УФ-облучение в присутствии серотонина: 2 — в концентрации 1О’^в моль/л, 3— 10"⁷ моль/л, 4— 10"⁸ моль/л

С целью детализации представлений, касающихся выяснения механизма защитного действия серотонина по отношению к мо­лекулам ЛДГ, при помощи метода ИК-спектрофотометрии были исследованы особенности вторичной структуры изофермента М₄ из скелетных мышц свиньи в нативном состоянии и в присут­ствии биогенного амина.

Анализ соотношения интенсивностей поглощения в полосах амид I и амид II на частотах, являющихся характеристическими для отдельных элементов вторичной структуры, свидетельствует о том, что присутствие биогенного амина индуцирует увеличение доли беспорядочной структуры в молекуле фермента (табл. 15). При этом отмечаемый прирост ее реализуется за счет как а-спи- ральных участков, так и p-складчатых слоев. В случае соотноше­ния молекул ЛДГ и экзогенного модификатора 1:1 наблюдаемый эффект в большей степени обусловлен участием а-спиралей, вхо­дящих в состав белка.

Таблица 15

Соотношение полос поглощения, характеризующих основные типы вторичной структуры белковой молекулы, для лактатдегидрогеназы в свободном состоянии и в присутствии серотонина

* Отличие от контроля статистически достоверно.

Изменение спектральных характеристик фермента удается обнаружить и на других участках спектра. При соотношении молекул ЛДГ и серотонина 1:1 статистически достоверно умень­шается интенсивность поглощения образцов на частотах 1468, 1420 см^-1 по сравнению с нативным белком; отмечается появле­ние нового максимума на частоте 1502 см^-1.

Повышение концентрации экзогенного модификатора в 10 раз сопровождается снижением интенсивности поглощения на час­тоте 1432 см'¹. Вместе с тем в области 1440—1380 см'¹ регистри­руется выраженный пик с максимумом при 1404 см'¹. Для на­тивного белка поглощение в этом участке незначительно, а при соотношении компонентов изучаемой системы 1:1 практически отсутствует. ИК-спектр свободного фермента характеризуется на­личием широкой полосы поглощения в области 1370—1180 см^-1, Добавление к его раствору серотонина приводит к ее сглажива­нию и при соотношении молекул ЛДГ — биогенный амин 1:10 в данном диапазоне отмечается практически монотонное убыва­ние светопропускания образца.

Таким образом, выявлен выраженный фотопротекторный эф­фект серотонина по отношению к молекулам изоферментов Н₄, Н₃М, Н₂М₂ ЛДГ эритроцитов человека, обусловленный образова­нием комплекса ЛДГ — серотонин, формирование которого зат­рагивает вторичную структуру белка. Возможно, комплексиро- вание биогенного амина с молекулами фермента происходит и в растворе. Однако полученные результаты не исключают и веро­ятность дезактивации серотонином АФК, в том числе

Динамический комплекс с молекулами ЛДГ способен образо­вывать и его кофактор NADH, что может существенно изменять фоточувствительность фермента. С целью расширения представле­ний, касающихся выявления механизма УФ-модификаций ЛДГ в присутствии кофермента, были проведены эксперименты по изуче­нию фотостабильности молекул ЛДГ (М₄) из скелетных мышц сви­ньи в условиях различной занятости ее активных центров этим кофактором. Степень занятости активных центров фермента NADH рассчитывали по формуле (Ч. Кантор, П. Шиммел, 1985):

_Y_ [NADH]

K_dis+[NADH]’

где Y — степень насыщения белка лигандом; [NADH] — концен­трация кофактора; K_dis — константа диссоциации комплекса бе­лок — лиганд (в качестве К_Дз использовали значение константы Михаэлиса 2,5-10"° моль/л для NADH по отношению к изоформе М₄) (С. Е. Северин, Г. А. Соловьева, 1989) .

Установлено, что предварительное добавление NADH (4-Ю'⁸ моль/л) к ЛДГ (10~⁸ моль/л), УФ-облучаемой в дозе 3,02 кДж/м², не вызывает статистически достоверных изменений степени инактивации свободного белка (32 %). Y в данном слу­чае — 0,16 %. При концентрации NADH 4-Ю"⁷ моль/л (Y = 1,57 %) обнаруживается эффект сенсибилизации (13 %). Фотомодифика­ция ЛДГ в присутствии кофермента в концентрациях 4-Ю*⁶ (Y = 13,8 %) и 2,5-10*° моль/л (Y=50 %) приводит к регистрации протекторного эффекта NADH по отношению к ферменту: степень УФ-инактивации белка в этом случае соответственно на 9,3 и 16,0 % ниже уровня активности ЛДГ, облученной без кофактора.

Путем одноэлектронного окисления NADH и при восстанов­лении NAD⁺ может образовываться радикал NAD’, взаимодей­ствующий с кислородом с образованием супероксидного анион- радикала О/, поражающего белковую глобулу. Вместе с тем вос­становленная форма кофактора обладает способностью дезакти­вировать ¹О₂: константа скорости тушения синглетного кислоро­да в системе CH₃CN : D₂O (4:1) — 7,5-Ю⁷ л-(моль-с)*¹; в D₂O — 2,1-Ю⁷ л-(моль-с)'¹. Следовательно, значение ее для NADH состав­ляет 1,7-10*⁴ — 1,5-10*² моль/л. NADH способен взаимодейство­вать с О/, причем выявлено, что его окисление супероксидом идет быстрее, если кофактор образует.комплекс с ЛДГ: констан­та скорости окисления NADH в последнем случае по меньшей мере на 4 порядка выше таковой для свободного лиганда. Окис­ление NADH в активном центре фермента, по-видимому, должно происходить по цепному механизму и существенным образом изменять химические свойства кофактора.

Спектр поглощения комплекса ЛДГ (2-Ю^-8 моль/л) — NADH (2-Ю*⁸ моль/л) характеризуется двумя полосами поглощения с Х_гаш[ при 268 и 340 нм. Присутствие полосы с А,_зпах 268 нм в спек­тре поглощения изучаемой системы можно объяснить индукци­ей структурных изменений молекулы апофермента путем при­соединения кофактора. D. Scherr и соавт. (1973) исследовали спек­тральные свойства двойных комплексов, образующихся при вза­имодействии аналогов или фрагментов NADH с ЛДГ из сердца свиньи. Комплексообразование вызывало спектральные измене­ния в области 280 нм, что указывает на участие в этом процессе ароматических аминокислот. Авторы постулировали гидрофоб­ный характер взаимодействия адениновой части коэнзима с апо- белком.

Таким образом, суммарный регистрируемый эффект измене­ния каталитической активности ЛДГ при ее УФ-облучении бу­дет зависеть от соотношения процессов сенсибилизации и протек­торного эффекта NADH. Защитное действие кофермента (Y = 13,8 и 50 %) может быть обусловлено реализацией следующих воз­можных процессов:

1) формированием более фоторезистентной конформации ЛДГ в комплексе с NADH по сравнению с апоферментом;

2) миграцией энергии с возбужденных аминокислотных ос­татков белка (в частности, триптофана) на кофермент;

3) акцептированием АФК (Ю,, и О₂^Д);

4) экранирующим эффектом NADH в области длин волн 240— 280 нм.

Фотосенсибилизирующий эффект NADH по отношению к ЛДГ, по-видимому, объясняется образованием при УФ-облучении бел­ка сольватированного электрона, акцептируемого NAD⁺, в резуль­тате чего в присутствии О₂ возможен циклический процесс пере­хода NAD⁺ — NAD' с генерированием О₂~ и других активных интермедиатов (NAD-, Н₂О₂). Кроме того, вследствие конформа­ционных переходов протомеров ЛДГ при фотоокислении NADH могут формироваться субъединицы, занятые одновременно вос­становленной и окисленной формой кофактора, что существенно изменяет характер УФ-превращений, индуцируемых в системе фермент — кофермент.

Изучение роли АФК в процессах фотомодификации белка су­щественно дополняют исследования фотосенсибилизированного метиленовым голубым (МГ) фотоокисления изофермента М₄ ЛДГ. Механизм действия красителя связан с генерацией ¹О₂ или непосредственным взаимодействием возбужденной молекулы МГ с молекулой белка. Преобладание в системе тех или иных про­цессов зависит от соотношения концентраций биополимера и кра­сителя в облучаемой системе.

Из анализа данных, представленных на рис. 58, а, следует, что облучение красным светом изофермента М₄ (10"⁸ моль/л) в тече­ние 15 мин с МГ (Ю^-7 моль/л) не вызывает статистически досто­верных изменений функциональных свойств ЛДГ по сравнению с уровнем активности белка, облученного в отсутствие красителя.

Рис, 58, Зависимость ферментативной активности ЛДГ (М₄), облу­ченной красным светом в присутствии азида натрия (3,2-10~³ моль/л), от концентрации метиленового голубого: а — концентрация фермен­та— 10^-8 моль/л; б — 10"° моль/л; в —10“⁷ моль/л; А_о — активность фермента, облученного в течение 15 мин красным светом без модифи­каторов; 1 — ЛДГ; 2 — ЛДГ+NaNg

Добавление МГ в концентрациях 10^Чі, 10^ и 10"* моль/л сопровож­далось эффектом сенсибилизации: активность ЛДГ снижалась на 26,7±6,0; 11,0±1,8 и 17,4±2,6% соответственно. В присутствии NaN₈ остаточная активность фермента после его облучения с МГ (10^_в моль/л) составляет 87,8±3,6%, что свидетельствует об учас­тии *О₂ в процессе фотоинактивации ЛДГ (10^-8 моль/л).

При использовании растворов фермента (10^_в моль/л) максимальный сенсибилизирующий эффект МГ обнаруживается при его концентрации КР моль/л и составляет 30,0±4,0 %, а оста­точная активность белка, облученного в присутствии азида натрия, равна 90,3±2,4% (рис. 58, б). Аналогичные результаты были полу­чены при исследовании фотосенсибилизированного окисления сер­дечной изоформы ЛДГ с участием МГ моль/л).

Для ЛДГ (1О'^Т моль/л) в присутствии МГ характер изменения функциональных свойств ЛДГ от концентрации красителя при об­лучении их смеси оказался иным: активность фермента убывает с ростом концентрации МГ, а степень инактивации достигает мак­симальной величины (23,2±4,5%) при концентрации сенсибили­затора 10"* моль/л (рис. 58, в). При добавлении в систему азида натрия значения исследуемого параметра не отличались от тако­вых для ЛДГ, фотомодифицированной в свободном состоянии.

Взаимодействие фермента с синглетным кислородом может осу­ществляться при относительно высоких концентрациях белка, так как ¹О₂ характеризуется малым временем жизни. Этим, вероятно, объясняется отсутствие протекторного действия NaN_a для низких концентраций фермента. При определенных концентрациях МГ (10*^в и 10~* моль/л) возможно тушение его триплетного состояния своими же молекулами или взаимодействие их с *0,,; этот поража­ющий агент не достигает активного центра белка. Кроме того, фо­тоинактивация ЛДГ может быть связана с комплексированием мо­лекул красителя с поверхностными участками белковой глобулы, что благоприятствует протеканию реакций по типу I, т.е. обуслов­лена непосредственным химическим взаимодействием триплет­ных состояний сенсибилизатора с аминокислотными остатками фермента.

Суммируя результаты исследования УФ-индуцированных из­менений структурно-функционального состояния изоферментов ЛДГ в условиях их различного микроокружения, можно заклю­чить, что основной тип УФ-модификации каталитической актив­ности изоформ ЛДГ (мышечного и сердечного типов) — фото­инактивация ее молекул. На основании определения величин кон­станты скорости инактивации и времени полупревращения изо­ферментов ЛДГ показано, что сердечная форма фермента (Н₄) бо­лее фотостабильна по сравнению с мышечной (М₄). Использова­ние широкого спектра экзогенных соединений (азида натрия, 13- каротина, D-маннита, гистидина, серотонина, NADH), способных акцептировать АФК и проявлять в определенных концентраци­ях фотопротекторное действие по отношению к молекулам ЛДГ, позволило выявить существенную роль синглетного моле­кулярного кислорода в процессе фотоинактивации ЛДГ. При исследовании сенсибилизированного МГ фотоокисления изоформ

Рис. 59. Схема возможных физико-химических процессов, приводя­щих к фотоинактивации молекулы лактатдегидрогеназы

фермента показана возможность окисления ЛДГ (М₄) синглет­ным кислородом при его экзогенной генерации.

На рис. 59 представлена схема возможных процессов, способ­ных приводить к фотоинактивации ЛДГ.

Результаты проведенных исследований углубляют современ­ные представления об особенностях фотохимических превраще­ний и функциональных нарушений отдельных изоферментов ЛДГ, индуцированных воздействием УФ-излучения. Их необходимо учитывать при изучении первичных и начальных процессов УФ- изменений сложных белков с доменной структурой. Кинетичес­кие исследования фотоокисления ЛДГ в присутствии протекто­ров, акцептирующих активные промежуточные продукты фото­превращений белка, позволят оценить реальный вклад каждой элементарной стадии (реакции) в сложный процесс УФ-модифи­кации субъединичной молекулы этого фермента.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Какие компоненты биомембран являются акцепторами УФ-излу­чения?

2. Что понимают под термином “перокеидное фотоокисление ли­пидов” мембран?

3. Каковы механизмы протекания процесса пероксидного фотоокис­ления липидов мембран?

4. Чем обусловлены изменения структурно-функционального состо­яния простых и сложных белков под влиянием УФ-излучения?

5. В чем заключаются особенности фотохимических превращений мембраносвязанных белков по сравнению со свободными?

6. Что представляет собой эффект фотохимической аллотопии? Ка­ковы условия проявления и исчезновения феномена фотохимической аллотопии?

7. Что называют фотосенсибилизаторами?

S. Каковы механизмы протекания фотосенсибилизированных реак­ций?

9. В чем состоит роль синглетного молекулярного кислорода в реа­лизации фотосенсибилизированных процессов?

10. Охарактеризуйте методы выявления и оценки роли синглетного кислорода в различных фотосенсибилизированных и темновых реакциях.

11. Что называют акцепторами и тушителями синглетного молеку­лярного кислорода? Как оценивают способность этих соединений взаи­модействовать с ’О₂?

12. Какие биологические молекулы являются наиболее эффектив­ными тушителями синглетного кислорода, а какие — малоэффектив­ными?

13. В чем заключаются различия химического и физического меха­низмов тушения Ю₂ биомакромолекулами?

14. Каковы “последствия” фотосенсибилизированного повреждения молекулярных компонентов биомембран?

15. Опишите последовательность реакций, индуцированных воздей­ствием УФ-света на отдельные мембранные компоненты и приводящих к нарушениям структурно-функционального состояния биомембран.

16. Какое теоретическое и практическое значение для медицины имеют исследования, направленные на изучение закономерностей фо­тохимических превращений биополимеров, их надмолекулярных комп­лексов и биомембран?