Самый маленький электрический мотор в природе

Все ферменты красивы, но АТРсинта- за — один из наиболее красивых, необыч­ных и важных.

Р. Воуег [116]

Наиболее важный вклад в наше сегодняшнее знание каталитиче­ской компоненты АТРсинтазы был сделан в лаборатории Уокера [73].

Рассмотрим более подробно детали структуры АТРсинтазы мито­хондрий, изображенной на рис. 4.26. Комплекс F! погружен в водную фазу и содержит, как уже было сказано, 9 субъединиц: За, ЗД 7,6, е. Гексамер (За + 3/3) имеет форму слегка приплюснутой сферы высотой 8 нм и шириной 10 нм. Центр сферы связан с выступом р субъеди­ницы, нижняя часть которой выдвинута из сферы примерно на 3 нм в комплекс F_o. Субъединица б соединяет верхнюю часть гексамера. Субъединицы 7 и є подвижны. Они образуют ротор, вращающийся внутри статора — гексамера (За + зр).

Комплекс F_o скрепляет АТРсинтазу с мембраной и имеет про­тонные каналы для переноса ионов водорода между водной фазой и мембрану сквозь АТРсинтазу. Комплекс F_o включает субъедини­цу а, две субъединицы Ь и довольно много субъединиц с. Гидрофобная субъединица а почти полностью погружена в мембрану, а ее длинные ответвления («руки») прочно связаны с комплексом F,. Это делает весь гексамер (За + 3/3) неподвижным и включает его в статорную часть машины. Каждая субъединица с состоит из 9-12 одинако­вых маленьких белков, окружающих субъединицу 7, погруженную в мембрану.

Имеются убедительные доказательства того, что роторная часть АТРсинтазы действительно вращается как во время синтеза, так и ги­дролиза АТР Мы опишем здесь только два типа экспериментальной техники, разработанных немецкими [74] и японскими [75, 76] учеными.

Юнге и его сотрудники [74] регистрировали вращательное дви­жение 7 субъединицы, пометив ее химически связанным эозиновым красителем. Гексамер (За + 3/3) сделали неподвижным, прикрепив его к ионно-обменной смоле. Вращение эозина меняет его ориентацию в пространстве и некоторые его оптические характеристики. Было обнаружено, что характерное время поворота эозина составляет око­ло 100 мкс, что практически совпадает со временем, требуемым для гидролиза одной молекулы АТР изолированным комплексом Fj. Вра­щение происходит только во время работы фермента и блокируется ингибиторами гидролиза АТР.

Более впечатляющими были, однако, эксперименты группы япон­ских ученых [75,76]. В этих работах авторы непосредственно наблюдали вращение 7 субъединицы с помощью люминесцентного микроскопа. Чтобы видеть вращение 7 субъединицы, авторы прикрепили к ее выступающей из F_t нижней части специальный маркер — фрагмент актина (один из мышечных белков). Актиновая нить длиною около 1 мкм была в свою очередь помечена молекулами флуоресцирующе­го красителя. Статорная часть фермента была сделана неподвижной практически тем же способом, как и в [74].

Как уже было сказано, вращение наблюдается как при синтезе, так и при гидролизе АТР. Экспериментально с гидролизом работать значительно проще, и большая часть данных была получена при ис­следовании АТРазной активности АТРсинтазы.

В экспериментах Киноши и его сотрудников [76] наблюдали, что молекула Fj вращает актиновый «хвост* дискретными скачками, пово­рачивая за один скачок на 120°. Один скачок соответствует гидролизу одной молекулы АТР. Средняя скорость вращения зависит от нагруз­ки: чем длиннее актиновая нить, тем реже скачки. В отсутствии АТР (без гидролиза) однонаправленного вращения не наблюдали. Можно было видеть лишь очень редкие случайные скачки в обоих напра­влениях, обусловленные тепловым движением. Эффективность мотора АТРсинтазы была очень высока. Работа, выполняемая мотором для поворота актиновой нити на 120° (преодолевая трение), почти точно равна энергии, запасенной в одной молекуле АТР.

Силу, вызывающую движение ротора Fj, когда АТРсинтаза обра­зует АТР, создает поток протонов через специальный канал. Бло­кирование протонного канала ингибитором, действующим на одну из субъединиц с, приводит к прекращению вращения и синтеза АТР. Протонный канал АТРсинтазы находится между а и с субъединицами. Путь протонного переноса включает следующие элементы структуры (рис. 4.26).

1. Две половины протонного канала. Одна расположена со стороны мембраны и контактирует с водным резервуаром. Эта половина канала обеспечивает доставку протонов к определенным функцио­нальным группам внутри мотора. Вторая половина канала, напра­вленная к другой стороне мембраны, обеспечивает выход протонов в «щелочной* резервуар (область с более низкой концентрацией протонов). Эти две половины канала смещены относительно друг друга и поэтому, вероятно, не соприкасаются.

2. Кольцо субъединиц с. Каждая из этих субъединиц содержит внутри карбоксильную группу, способную связывать протон из кислой

области (RCOO^-+Н⁺ ------------- ► RCOOH) и передавать его в щелочную

(RCOOH ---------- > RCOO” + Н⁺).

Таким образом, аминокислоты с карбоксильными группами игра­ют определяющую роль в работе протонных каналов. Элементарные

акты присоединения и диссоциации Н⁺ приводят к возникновению конформационно неравновесных состояний белка. В ходе последую­щей конформационной релаксации реализуется выполнение полезной работы: поворот ротора на 120°, который позволяет новой р субъ­единице присоединить субстраты фосфорилирования, образовать без затраты энергии АТР и осуществить акт выброса прочно связанной АТР в водную фазу (рис. 4.28).

После первых пионерских работ появилось несколько статей с бо­лее подробным описанием структуры и функционирования этого уни­кального электрического мотора [77—79].

Совсем недавно аналогичный подход был использован Бекке­ром [80] для описания работы миозиновой АТРазы, ответственной за мышечное сокращение.

Мы описали здесь конструкцию и способ действия только одной биохимической молекулярной машины. До настоящего времени это сделано примерно для дюжины ферментов, и это число быстро растет вместе с потоком публикаций.

Подведем теперь итоги общим идеям главы. Функционирование фермента (включая процесс внутриклеточной трансформации энергии) обеспечивается участием выделенных механических степеней свобо­ды в макромолекулярных конструкциях — машинах. Катализируемая ферментом химическая реакция начинается с локального возмущения, которое вызывает образование конформационно неравновесного со­стояния макромолекулярного комплекса (фермент—субстрат). В био­логических системах превращение субстрата в продукт, как и любой другой связанный с энергией акт, осуществляется в ходе конформаци­онной релаксации таких комплексов.

Молекулярные машины в биологических системах работают не так, как обычные макроскопические тепловые машины. Тепловые степени свободы нельзя рассматривать как резервуар, энергия которо­го непосредственно используется для реализации элементарного акта ферментативной реакции.

Общие идеи о роли «сохраняемой энергии», «конформацион­ной релаксации вдоль выделенных механических степеней свободы»,

«возмущение локальными зарядами» и т. д. в важнейших биологических процессах, которые были независимо выдвинуты в начале семидеся­тых несколькими группами ученых [1,31,35,41,49-52,60], получают теперь экспериментальное подтверждение.

Очевидно, «проблема стрелок», сформулированная в начале этой главы, принадлежит к числу решаемых.