ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Результаты работы свидетельствует о том, что условия in vitro хранения являются стрессовыми для длительно сохраняемых микрорастений. При этом у растений в процессе хранения в условиях in vitro происходит изменение ряда биохимических процессов, которые являются ответной защитноприспособительной реакцией организма на стрессовое воздействие среды.
Одной из поставленных задач работы являлось изучение способности к клональному микроразмножению и способности к длительному хранению in vitro различных сортов малины, ежевики, земляники. В результате исследований было выявлена межвидовая и внутривидовая (среди сортов) изменчивость по способности к микроразмножению и по способности к длительному хранению in vitro. Также было показано, что в результате 12-месячного хранения при +4θC выживает большее количество микрорастений ежевики, чем при +22θC. Установлено, что наиболее высокой жизнеспособностью в условиях низкотемпературного хранения in vitro среди изученных образцов обладают микрорастения земляники, наименьшей — микрорастения малины.
Выявлено, что между значениями коэффициента микроразмножения и способностью к выживанию растений малины и земляники в условиях хранения in vitro при +4oC существует положительная связь. Так, среди сортов малины наиболее высокий коэффициент микроразмножения и высокая выживаемость были характерны для растений сорта Mandarin; у сорта Красноплодный Сеянец, которые имели наименьшие значения KMP, выживших растений к 20-месяцу не оставалось. Среди изученных сортов земляники микрорастения сорта Polka имели наиболее высокие показатели выживаемости и в то же время одни из наибольших значений KMP; растения сорта Red Gauntlet отличались самой низкой выживаемостью и наиболее низкими значениями KMP.
Следующей задачей работы являлось изучение динамики морфологических показателей микрорастений различных сортов ежевики, малины и земляники, сохраняемых в условиях хранения in vitro.
Было отмечено, что в течение первых 4-месяцев рост микрорастений ежевики при +22oC происходит интенсивней, чем при +4oC, и затем замедляется. Также отмечено, что среди исследуемых культурнаиболее интенсивный рост в условиях низкотемпературного хранения in vitro характерен для растений земляники, которые отличились от сортов ежевики и малины более высокой выживаемостью.
Еще одной задачей исследования было изучение изменения уровня хлорофиллов а и Ь, свободного пролина, аскорбиновой кислоты, пероксида водорода, а также активности пероксидаз у сохраняемых при +4oC микрорастений ежевики.
Считается, что одним из факторов устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды является скорость формирования у них защитно-приспособительных реакций пигментной системы (Косарева, 1987). Для изучения влияния условий низкотемпературного хранения in vitro на микрорастения мы анализировали содержания хлорофиллов. В условиях in vitro хранения для всех сортов ежевики было характерно снижение содержания хлорофиллов, при этом у сорта Bodega Bay снижение содержания хлорофиллов было выражено в большей степени, в то время как у сорта Whitford Thomless наблюдалось незначительное их снижение. Это может быть связано с тем, что в ответ на стрессовые воздействия условий хранения in vitro биосинтез хлорофиллов подавляется, что является причиной снижения количества хлорофиллов.
Известно, что при стрессовых ситуациях в растительном организме накапливаются АФК, к которым относится и пероксид водорода (Arnao et al., 1990; Baynton et al., 1994). Изменение метаболизма АФК играет центральную роль в определении ответа растений на различные стрессовые воздействия, в том числе и на холод. В нашей работе выявлена тенденция к наличию обратной зависимости между активностью пероксидаз и уровнем пероксида водорода. В течение первых 8 месяцев хранения растений ежевики активность пероксидаз увеличивается, а количество пероксида водорода фактически не меняется. Это говорит о том, что в начальный период хранения микрорастений пероксидазы способствуют поддержанию низкого уровня пероксида водорода.
При дальнейшем хранении микрорастений активность пероксидаз снижается, в то время как уровень пероксида водорода повышается. Это может объясняться тем, что высокий уровень пероксида водорода инактивирует работу пероксидаз (Prasad et al., 1994). Поэтому пероксидазы, вероятно, не способны справляться длительное время с избыточным образованием пероксида водорода. Зависимость уровня пероксида водорода от активности пероксидаз наблюдается и при сравнении отдельных сортов ежевики. Наиболее высокий уровень пероксида водорода через 12 месяцев хранения (по сравнению с исходным) был отмечен у сортов Silvan (433%) и Whitford Thomless (292%), наименьший - у сорта Merton Thomless (118%).Наиболее интенсивное (по сравнению с исходным уровнем) повышение активности пероксидаз во время хранения наблюдалось, наоборот, у сорта Merton Thornless (299%) и наименее интенсивно повышается активность пероксидаз у сорта Whitford Thomless (113%).
Отмечена тенденция к обратной связи между содержанием пероксида водорода и активностью пероксидаз в верхних и нижних листьях во всех сроках хранения. Так, уровень пероксида водорода в листьях верхнего яруса выше, чем в листьях нижнего яруса, в то время как активность фермента выше в листьях нижнего яруса, чем в листьях верхнего.
Известно, что тесная корреляция между водным дефицитом ткани и накоплением в ней пролина позволяет принять степень его накопления в качестве теста для определения оводненности ткани (Проценко и др., 1975). Известно, что воздействие холода также сопровождается и обезвоживанием тканей (Pearce, 1999). Выявлена зависимость между количеством свободного пролина и засухоустойчивости пшеницы (Sing, Prasad, 1979), а также ее холодостойкостью (Проценко, Мишустина, 1962). Содержание свободного пролина у томатов может служить показателем их холодостойкости (Проценко, Мишустина, 1962). Поскольку хранение микрорастений ежевики осуществлялось при низкой положительной температуре, устойчивость к холоду является одним из важных параметров для сохраняемых в условиях in vitro растений.
Поэтому изменение уровня пролина можно рассматривать как один из главных биохимических процессов, играющий важную роль при приспособлении микрорастений к условиям низкотемпературного хранения.В изменении количества пролина при хранении в условиях in vitro обнаружена та же тенденция как при изменении активности пероксидаз. Так, его количество в течение первых 4 месяцев хранения повышалось, а затем снижалось. Накопление свободного пролина при стрессовых ситуациях может осуществляться в результате обратимого нарушения аллостерической регуляции конечным продуктом ключевых ферментов биосинтеза, повышения активности генов, управляющих биосинтезом пролина, изменения проницаемости митохондриальной мембраны для пролина (Шевякова, 1983). Резкое повышение содержания пролина у ежевики в начальный период низкотемпературного хранения объясняется тем, что условия хранения in vitro влияют на микрорастения как стрессовый фактор. Дальнейшее снижение содержания пролина, вероятно, связано с адаптацией хранящихся микрорастений к неблагоприятному воздействию условий низкотемпературного хранения in vitro.
В литературе встречаются данные о том, что устойчивые к холоду растения накапливают пролин больше, чем слабоустойчивые (Вечер, Гончарик, 1973). Неодинаковая способность к накоплению свободного пролина, очевидно, является генетически детерминированной нормой реакции на стресс у различных видов и сортов растений (Шевякова, 1983). Предполагается, что участие пролина в защитных реакциях у устойчивых видов или сортов растений является постоянным, в то время как у менее устойчивых растений это свойство проявляется при воздействии стрессора (Таї, 1979). Эти данные подтверждаются результатами нашей работы. Так, содержание свободного пролина в начальный период хранения (во время адаптации растений к условиям низкотемпературного хранения in vitro) у более устойчивых сортов ежевики повышается в большей степени (Silvan - уже к 4-месяцу, Merton Thomless - 8-месяцу хранения), чем у менее устойчивых.
Далее при снижении его содержания остается наиболее высоким у тех же сортов.Таким образом, можно сделать вывод о связи между накоплением свободного пролина и устойчивостью микрорастений к низкой температуре в условиях хранения in vitro, наиболее четко проявляемой в период их вегетативного развития, то есть в начальный период хранения. Показано, что существует зависимость между жизнеспособностью микрорастений исследуемых сортов ежевики при низкотемпературном хранении in vitro и процессом накопления свободного пролина. Исходя из вышеприведенных данных, можно сделать заключение о том, что степень изменений содержания свободного пролина зависит от устойчивости растения, продолжительности действия стрессовых факторов (то есть длительности хранения).
То есть, скорость накопления свободного пролина также можно использовать в качестве теста для определения способности растительного организма адаптироваться к стрессовым условиям низкотемпературного хранения in vitro, то есть для выявления устойчивых к этим условиям образцов.
В утилизации пероксида водорода, а также во многих других процессах, происходящих в ответ на стрессовые воздействия в растительном организме, участвует аскорбиновая кислота. В нашей работе во время хранения в условиях in vitro у всех сортов ежевики количество восстановленной аскорбиновой кислоты резко снижалось. При этом достоверных различий у разных сортов по ее исходному количеству и последующему снижению не наблюдалось. Резкое снижение содержания аскорбиновой кислоты может объясняться тем, что условия низкотемпературного хранения in vitro являются стрессовыми для сохраняемых микрорастений. В литературе встречаются данные о том, что изменение количества аскорбиновой кислоты по мере развития и роста растений коррелирует с торможением их роста (Pei et al., 2000). Это обстоятельство также может быть одной из причин снижения концентрации аскорбиновой кислоты, поскольку во время хранения при низкой положительной температуре рост микрорастений ежевики замедляется.
Данные, полученные в нашей работе, свидетельствуют о том, что условия низкотемпературного хранения in vitro являются стрессовыми и вызывают значительные изменения в метаболизме веществ у хранящихся в этих условиях микрорастений ежевики, сказываясь, в частности, на биосинтезе хлорофиллов, свободного пролина, пероксида водорода, а также в изменении активности пероксидаз и снижении уровня аскорбиновой кислоты.
Изучение изменения биохимических показателей (содержание аскорбиновой кислоты, свободного пролина, активности пероксидаз) у растений, хранящихся в условиях низкотемпературного хранения in vitro, позволяет рекомендовать эти показатели для использования их в дальнейшем в целях диагностики устойчивости растений к этим условиям. Результаты анализов физиолого-биохимических показателей выявили, что сорта, у которых происходит интенсивное накопление свободного пролина и повышение активности пероксидаз, обладают более высокой устойчивостью, чем другие исследуемые сорта ежевики. Исходя из вышеприведенных данных, можно сделать вывод, что сорта Silvan и Merton Thomless более устойчивы к условиям низкотемпературного хранения in vitro по сравнению с другими исследуемыми сортами ежевики.
Итак, через 12 месяцев хранения in vitro у микрорастений уровень АФК (пероксида водорода) возрастает, а активность пероксидаз и содержание аскорбиновой кислоты снижается. Это можно объяснить тем, что условия длительного низкотемпературного хранения in vitro являются стрессовыми, приводящими к значительной гибели микрорастений после 20 месяцев хранения. Можно полагать, что при хранении пробирочных растений до одного года наблюдаемые защитные реакции растительного организма компенсируют разрушительное воздействие стрессовых условий хранения. Поэтому через 12 месяцев хранения in vitro большая часть микрорастений (не зависимо от вида и сорта) остается жизнеспособной; RAPD-спектры сохраняемых in vitro микрорастений не отличаются от спектров исходных растений. Данный срок (12 месяцев) можно рекомендовать для депонирования in vitro коллекций малины, ежевики, земляники при низких положительных температурах.
Результаты нашей работы могут послужить основой для дальнейшего углубленного исследования процессов, происходящих при приспособлении растений к условиям хранения in vitro∖ а также может стать базой для проведения селекционных работ по признаку устойчивости растений к условиям хранения in vitro.