Глава 7. БИОЛОГИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

Сам факт мощного (и управляемого) химического действия ла­зерного излучения, которое мы рассматривали выше, вызывает вопрос о практическом использовании такого излучения в медико­биологических задачах.

Видимо, следует оставить в стороне примитивные и часто совсем шарлатанские интерпретации биологического действия лазерного излучения типа «энергоинформационного поля», «биополя» и др., которые не имеют смысла уже потому, что пока не предсказали ни одного эффекта. Нельзя сказать, что эти объяснения противоречивы. Более того, такие объяснения всегда «правильны», поскольку, за счет смутных (умозрительных) определений невероятно большого числа основных понятий, они в принципе не могут содержать ника­ких противоречий. Как следствие, эти модели всякий раз легко мо­дифицируются при объяснении новых наблюдений. Ясно, что все это является просто формой средневековой схоластики и не может иметь отношения к серьезной науке, которая всегда имеет целью давать проверяемые предсказания, а не просто объяснения.

Невозможно рассматривать методы анализа процессов в каком- либо объекте, не ознакомившись, хотя бы кратко, с основными свой­ствами этого объекта. Поэтому для анализа биологического действия лазерного излучения приведем некоторые сведения из биологии и биофизики. Эти сведения, конечно, ни в коей мере не составляют содержание биофизики, а лишь акцентируют внимание на некото­рых (важных для дальнейшего) особенностях живых организмов.

Некоторые сведения из биофизики. Строение биологических

объектов. Прежде всего необходимо представлять себе строение

биологических объектов. Основным - всегда имеющимся - элемен­том биообъектов является клетка (см. рис. 7.1). Клетка ограничена в пространстве клеточной мембраной, представляющей собой двойной слой молекул фосфолипидов. Фосфолипид, как ясно из названия, это молекула, состоящая из липидного (аналогичного жирам, и следовательно, гидрофобного) и фосфатного (гидрофиль­ного) остатков. Такие, как говорят, амфифильные молекулы, ока­завшись в воде стремятся упаковаться таким образом, чтобы «экс­понировать» в воду свои гидрофильные остатки и максимально «скрыть» от воды гидрофобные. Такие упаковки, естественно, про­сто минимизируют свободную энергию системы. Это приводит ко множеству вариантов упаковок, одной из которых и является двой­ной слой: гидрофильные остатки верхнего слоя и нижнего направ­лены наружу, а между ними «скрыты» гидрофобные липидные остатки. Часто, имея в виду клеточную мембрану, говорят просто «билипидный слой».

Обмен веществом с внешней средой в клетке осуществляется за счет мембранных белков («машин», в общем случае выполняющих довольно сложные функции). Так, трансмембранные белки обра­зуют т.н. ионные каналы, через которые проходят ионы определен­ного сорта в зависимости от состояния белка.

Внутри клетки содержатся органеллы: ядро, рибосомы, мито­хондрии и, в зависимости от клетки, другие органеллы (комплекс Гольджи и т.п.). Каждая органелла также окружена либо мембра­ной, либо, чаще, белковой оболочкой. В ядре находится основной генетический материал клетки: молекулы ДНК (дезоксирибонук­леиновой кислоты), зафиксированные в т. н. хромосомах с помощью белков-гистонов. Все молекулы ДНК представляют собой линей­ные (в спиральной конформации) полимерные макромолекулы, образованные всего четырьмя мономерными элементами (нуклео­тидами): аденином (А), цитозином (C), гуанином (G) и тимином (Т). Информация закодирована в последовательности нуклеотидов.

Основными исполнительными элементами клетки являются белки. Синтез белков, необходимых клетке, происходит в рибосо­мах по информации, считанной в ДНК и перенесенной к рибосоме с помощью транспортного РНК (рибонуклеиновой кислотой, ана­лог ДНК, в котором нуклеотид тимин заменен урацилом). Все бел­ки состоят из всего 20 аминокислот (точнее, 27 с учетом расти­тельных клеток). Известно, что каждая аминокислота белка в ДНК кодируется тройкой (т.н. «триплетом») нуклеотидов. Белки пред­ставляю собой линейные полимерные макромолекулы, в которой мономеры - аминокислоты - связаны так называемой полипептид­ной цепью. Последовательность аминокислот называется первичной структурой белка. В пространстве эта цепь упакована обычно сложным, неупорядоченным, но вовсе не случайным (т.е. вполне закономерным) образом. Пространственная структура макромоле­кулы называется ее конформацией. Для каждого белка существует огромное количество возможных конформаций. «Осмысленные» функции (например, ферментативный катализ) белки осуществля­ют только в какой-то определенной конформации, называемой на­тивной. Конформации относят к вторичной структуре белка. Как теперь известно, первичная структура белка полностью определяет его нативную конформацию. Различают также более высокие уровни организации белков: так называемые третичные и четвер­тичные структуры.

Основные химические процессы в клетках осуществляются с помощью белков в т.н. реакциях ферментативного катализа, где белки играют роль высокоспецифичных катализаторов. Молекула исходного вещества - субстрата - «захватывается» определенным конформационным элементом белка-фермента - так называемым активным центром. Белок, претерпевая последовательность кон- формационных переходов, вызванных неравновесностью нового состояния (белок + субстрат), превращает субстрат в продукт, ко­торый отщепляется от белка. Обратными конформационными пе­реходами белок возвращается в нативную конформацию.

Для осуществления этих и большинства других процессов в клетке требуются затраты энергии.

Заметим, что все это - только общая грубая схема клетки. В действительности клетки могут сильно различаться по строению.

Так, например, характерные размеры большинства клеток - от 1 до 10 мкм, однако, клетки нервной ткани - нейроны могут иметь отро­стки - аксоны длиной около метра; существуют клетки, не имею­щие ядра (например, эритроциты) и т.п.

Вся приведенная здесь информация является просто описанием, известным из биологии [14]. Отсюда еще никак не следуют базовые физические принципы функционирования живых систем. Эта зада­ча относится к основным принципам биофизики.

Физические принципы существования живых организмов.

Биофизика, как явствует из ее названия, область физики, призван­ная объяснять явления биологии с помощью физических принци­пов. Следовательно, можно ожидать, что пользуясь принципами биофизики, можно значительно облегчить нашу задачу - предска­зание биологического действия лазерного излучения.

В действительности положение дел несколько более сложно. Дело в том, что как физическая дисциплина, биофизика не только далека от завершения, но даже сами основные принципы этой нау­ки пока остаются спорными. В результате биофизика не является единой наукой, исходящей из общих законов, а скорее представля­ет собой набор моделей, более или менее правильно описывающих частные явления.

Совершенно очевидно, что все биологические объекты всегда и полностью подчиняются общим законам природы, в том числе за­конам физики. Тем самым, физика полностью применима для описа­ния явлений в биологии. Другой вопрос, является ли это описание достаточным, или должны быть введены какие-то дополнительные новые базовые положения биофизики. В 70 - 80 годы доминировал взгляд, что законов физики достаточно для объяснения биологиче­ских явлений.

Другая сложность, лежащая в основании биофизики, связана с различием в методах анализа в биологии и в физике. Очевидно, биофизика должна опираться на данные, полученные в биологии.

Полученные в опытах данные, естественно, должны обобщаться для выяснения более общих закономерностей. Это одинаково в физике и биологии. Но метод оказывается разным: так, в биологии принято так называемое финалистическое описание, т.е. объясне­ние по принципу «это для того, чтобы..»; в физике, напротив, опи­сание должно быть каузальным (т.е. причинно-следственным) - «это потому, что..». К счастью, это противоречие, как показал М.В. Волькенштейн, скорее кажущееся: так, в физике, любой за­кон, формулирующийся с помощью какого-либо вариационного принципа, также может быть сведен к биологической форме «для того, чтобы..». (Например, по принципу Ферма, свет «выбирает траекторию на границе двух сред так, чтобы время пути было ми­нимальным.. » и т.п.). Заметим, что в основе всех пяти основных физических теорий лежат некие вариационные принципы. Видимо, так должно быть и в биофизике. Другое дело, что соответствующие биологии вариационные принципы пока еще не полностью опреде­лены. Однако изложим то, что уже ясно.

Рис. 7.1. Схема строения клетки, мембраны и митохондрий 135

С точки зрения физики биологические объекты представляют со­бой самоподдерживающиеся системы взаимосвязанных химических реакций, открытые для энерго- и массобмена с внешней средой.

Долгое время было неизвестно, возможна ли в принципе самоор­ганизация (самопроизвольное увеличение упорядоченности) в каких- то системах химических реакций.

Реакция химических часов (Белоусова - Жаботинского). Реак­ция химических часов исторически была вначале открыта чисто экспериментально при изучении растворов солей церия. Лишь зна­чительно позже появилась интерпретация, основанная на принци­пах теории нелинейных колебаний.

Упрощенно и схематически система реакций может быть пред­ставлена следующими четырьмя уравнениями:

Здесь важно то, что для осуществления реакции концентрации на­чальных и конечных продуктов должны поддерживаться постоян­ными в пространстве и времени. Точнее, А, В, D, E поддерживают­ся постоянными во времени и пространстве. Поскольку эти веще­ства могут поглощаться (производиться) в указанных реакциях, это условие означает, что мы имеем дело с открытой системой, кото­рой всегда надо поставлять или удалять соответствующие реаген­ты; т.е. системой, находящейся в энергомассообмене с окружаю­щей средой. Это вполне аналогично обязательно открытому харак­теру процессов в любом живом организме.

Другой важной чертой является наличие положительной об­ратной связи в третьей реакции: производство вещества Х пропор­ционально его же концентрации. В химии такие обратные связи называются автокаталитическими реакциями. Автокаталитиче­ская стадия, включающая тримолекулярную реакцию, вводит в уравнения кинетики нелинейность, которая, как мы видели, являет­ся необходимым условием появления неустойчивостей.

Положим для простоты все кинетические константы равными

единице. Отклонение состояния системы от равновесия задано то­гда отношениями концентраций А/Е и В/D. Равновесие соответст­вует равенству

Изучение системы сильно упрощается в предельном случае

Физически это означает, что продукты D и E удаляются, как только они возникают. Степень отклонения системы от равновесия (коли­чественно характеризующаяся в химии понятием сродства) стре­мится при этом к бесконечности, т.е. система действует на «беско­нечном расстоянии» от равновесия. Кроме того, примем другое упрощение, состоящее в пренебрежении обратными реакциями в оставшихся двух стадиях. Схема, таким образом, становятся пол­ностью необратимой. В этом случае уравнения химической кине­тики становятся очень простыми:

Равновесное решение, т.е. особая точка системы, дается просто стационарным решением

Проводя исследование на устойчивость состояния равновесия со­гласно методам, изложенным в предыдущей главе, легко находим, что для состояние (7.4) неустойчиво. Вслед за неустойчивостью система эволюционирует к незатухающему периодическому режиму, пред­ставленному на рис. 7.2.

Исследование на устойчивость и анализ фазового портрета сис­темы (7.1) мы оставляем читателю в качестве упражнения. Из рис. 7.2 видно, что этот незатухающий режим достигается всегда, независимо от начальных условий. Его характеристики, например период или амплитуда колебания, являются, следовательно, внут­ренними свойствами системы и не зависят от начальных условий: напомним, такое поведение известно в нелинейной математике как предельный цикл.

Z

Рис. 7.2. Фазовые траектории в реакции химических часов: фор­мирование предельного цикла

(А = 1, В = 3); S - особая точка; (1), (2), (3) - траектории для раз­ных начальных условий

Тем самым, в системе химических реакций (7.1) возникает са­моорганизация во времени - предельный цикл. Главные условия существования этой самоорганизации - наличие автокаталитиче­ской стадии (т.е. положительной обратной связи) и открытость системы.

Несколько позже было экспериментально показано, что в систе­ме реакций (7.1) возможна также пространственная самоорганиза­ция. Эта самоорганизация выражалась в формировании сложных двух- и трехмерных структур с упорядоченным пространственным расположением цветов раствора. Для понимания этого явления оказалось достаточно учесть диффузию реагентов в пространстве. Предположим для простоты, что система эволюционирует в един­ственном пространственном измерении r. Уравнения химической кинетики, соответствующие системе реакции (7.1) с учетом диффу­зии, тогда имеют вид:

где D_x, D_y - коэффициенты диффузии реагентов X и Y. В этом слу­чае получение аналитических выражений значительно усложняется и характерные пространственные распределения обычно вычисля­ются численными методами. Физически понятно, что при неодно­родном распределении реагентов в пространстве в каждой точке пространства реакция будет находиться в той стадии, которая оп­ределяется концентрациями веществ в данном месте. По прошест­вии времени, даже если везде система реакций уже вышла на пре­дельный цикл, «фаза» этого цикла (конкретная точка на предельной кривой на рис. 7.2) будет различна. В итоге и формируется упоря­доченное пространственное распределение вещества. Другой при­чиной пространственной самоорганизации, как выяснилось, может быть установление новых обратных связей между диффузионными потоками.

Рис. 7.3. Пространственная самоорганизация в реакции Белоусова - Жаботинского: переходы порядок-хаос-порядок

Примеры пространственных распределений в реакции Белоусо­ва - Жаботинского приведены на рис. 7.3. Как видно из рисунка, при изменении параметров системы, она может последовательно эволюционировать от порядка к хаосу и затем к новому порядку.

Заметим, что все эти состояния являются существенно неравно­весными. Неравновесность поддерживается открытостью системы. Подобные свойства в значительной степени характерны и для жи­вых организмов.

Некоторые другие физические принципы теоретической биофизики. Тем не менее ясно, что от реакции Белоусова - Жабо- тинского еще бесконечно далеко до описания живого организма. Даже если считать, что основной принцип найден, то большая сложность биологических объектов все равно не позволит детально проанализировать поведение системы. Иными словами, количество связанных химических процессов в клетке столь велико, что долж­но характеризоваться нереально большим (макроскопическим) количеством параметров.

Но подобная ситуация уже встречалась в физике. Так, из ньюто­новых законов для макроскопических количеств молекул, в стати­стической физике приходят к ограниченному числу макропарамет­ров - температура, давление, энтропия и т.п. и в дальнейшем полу­чают закономерности, связывающие только эти макропараметры.

Такая попытка перехода к макропараметрам в нелинейных сис­темах химической кинетики, т.е. построение термодинамики от­крытых неравновесных систем, была осуществлена в работах При­гожина и Николиса еще в 70-е годы XX в. Как известно, из кинети­ческих характеристик можно составить функцию, имеющую физи­ческий смысл энтропии, сродство также можно полагать термоди­намическим параметром и т.п. Целью этих работ было установле­ние закономерности, выражающей условие существования нерав­новесных стационарных состояний через такие термодинамиче­ские параметры.

Первый принцип, который был получен на этом пути звучит как

условие минимума продукции энтропии. Для систем, находящихся вблизи равновесного состояния, функция производства энтропии в единицу времени («продукция энтропии») в неравновесном ста­ционарном состоянии должна принимать минимальное значение. Для систем, далеких от равновесия вторая вариация энтропии также должна быть отрицательной при достижении стационар­ного неравновесного состояния. Тем самым, как видим, были сформулированы некоторые недостававшие вариационные прин­ципы биологической физики.

Рис. 7.4. Биохимическая схема цикла Кребса

Эти принципы до сих пор лежат в основе теоретической биофи­зики. Однако, их использование по-прежнему затруднено сложно­стью даже элементарных процессов, таких, например, как фермен­тативный катализ и др. Заметным успехом в использовании этих принципов было построение математической теории эволюции Манфредом Эйгеном в 70е годы XX в. Правда, для этого ему при­шлось вводить не только понятие информации, но и довольно умо­зрительное понятие «ценности информации», которое делает всю теорию чисто феноменологической.

Итак, основные физические принципы функционирования жи­вых систем можно считать более или менее установленными. Для нашей задачи - выяснения механизмов биологического действия лазерного излучения - принципиальное значение имеет получаемое отсюда качественное объяснение пространственной и временной

самоорганизации в системах химических реакций.

Для нас здесь важно то, что подавляющее большинство процес­сов в живой клетке, как теперь установлено, имеют циклический характер. Так, основные химические процессы в клетках - процес­сы ферментативного катализа - вообще характеризуются такой величиной, как «число оборотов реакции в единицу времени».

Рис. 7.5. Схема работы мембранного натриевого канала

Для примера приведем еще несколько фактов временной само­организации в живых системах. На рис. 7.4 показан так называе­мый цикл лимонной кислоты (или цикл Кребса). Этот цикл входит в дыхательную цепь высших организмов. Механизм этого цикла был установлен экспериментально. Не следует думать, что временная цикличность характерна только для внутриклеточных реакций. Мембранные процессы, как оказалось, тоже цикличны. Для приме­ра на рис. 7.5 приведен цикл процессов функционирования натрие­вого канала в мембране клетки [14].

Физические механизмы биологического действия лазерного излучения. Итак, приведенные сведения прямо подсказывают принципиальный физический механизм биологического действия лазерного излучения. Читатель, вероятно, уже заметил прямую аналогию изложенных механизмов с механизмами предыдущей главы. В самом деле, биологические процессы представляют собой циклические химические реакции, вызванные существованием обратных связей и нелинейностью открытой системы. Действие же излучения на химические реакции, как мы видели выше, тоже чаще всего определяется возникновением обратных связей между концентрациями реагентов и параметрами излучения.

Таким образом, базовый механизм биологического действия ла­зерного излучения можно сформулировать так: лазерное излучение, в принципе, может приводить к образованию дополнительных обратных связей в системах биохимических реакций и, за счет этого, вызывать усиление или подавление протекающих процессов.

Однако, несмотря на принципиальную простоту и ясность этого объяснения, такой механизм оказывается реально подтвержденным лишь в ограниченном числе случаев. Важнейшим, как видели, ус­ловием возникновения обратной связи между реакцией и излуче­нием является резонансность поглощения. Посмотрим теперь, ка­кие вещества в клетках могут резонансно поглощать, например, излучение видимого, УФ- и ИК-диапазона.

Проникновение и поглощение излучения. Фосфолипиды явля­ются алифатическими (т.е. непредельными, не имеющими кратных связей) углеводородами. Это означает, что полосы электронного поглощения для них лежат уже на краю ВУФ-диапазона (< 150 нм) и недоступны большинству современных лазеров. То же относится к

воде и почти всем аминокислотам белков. Лишь три аминокислоты

имеют полосы поглощения в ближнем УФ-диапазоне (~ 250 - 310 нм): триптофан (Trp), тирозин (Tyr) и фенилаланин (Pha). Заме­тим, что эти аминокислоты присутствуют далеко не во всех белках.

Другими акцепторами излучения видимого диапазона могут яв­ляться комплексы белков с ионами металлов, например, гемогло­бин. Гемоглобин является основным переносчиком кислорода в высших организмах. Спектры поглощения окисленных и восста­новленной форм гемоглобина приведены на рис. 7.6. Однако ито­говый коэффициент поглощения крови оказывается не слишком высоким (десятки см^-1).

Рис. 7.6. Спектры поглощения дезокси- (1), окси- (2) и ферригемоглобина (3 )

Еще одним поглощающим веществом в красной области види­мого диапазона могут являться производные порфирина, которые также присутствуют в достаточных количествах далеко не всегда.

В области ближнего ИК-диапазона (~ 1 мкм) существует об­ласть относительной прозрачности (< 1 см^-1) большинства биотка­ней. В области валентных (~ 2 - 5 мкм) и деформационных (~ 5 - 20 мкм) колебаний молекул всегда присутствуют довольно интен­сивные (> 50 см^-1), но уширенные полосы O-H, C-H, C-N и другие молекулярных колебаний.

Итак, как видим, лишь ограниченное количество молекул может обеспечить резонансное поглощение и формирование описанного механизма обратной связи. Тем не менее, этот механизм все-таки может быть доминирующим. Его, например, всегда можно стиму­лировать путем разработки соответствующих способов доставки излучения до объекта терапевтического воздействия (например, облучение крови в системе с двумя катетерами и т.п.). Заметим также, что в силу свойств этого механизма (а именно, обратных связей), даже чисто тепловое воздействие лазерного излучения (т.е. при отсутствии микронеравновесности) может приводить к очень оригинальным результатам, вовсе не эквивалентным обычной ги­пертермии с помощью СВЧ-источников.

Но большинство практических задач лазерной медицины связа­но с воздействием in vivo (т.е. непосредственно на живую ткань). Здесь возникает другая трудность: если поглощение резонансно, то глубина поглощения света оказывается малой, точнее, чем больше поглощение, тем менее глубоко свет может проникнуть в ткань. Так, например, излучение четвертой гармоники неодимового лазе­ра (266 нм) практически полностью поглощается в эпидермисе (омертвевший верхний слой кожи), и, очевидно, не вызывает био­логических эффектов.

Тем самым, мы столкнулись с известным парадоксом: для мак­симального воздействия излучения требуется высокий коэффици­ент поглощения, но это приводит к очень малой глубине проникно­вения излучения и, как следствие, малому воздействию на орга­низм in vivo.

Это явилось одной из причин того, что большинство терапевти­ческих эффектов лазерного излучения наблюдают при воздействии почти нерезонансного излучения, преимущественно в красной час­ти спектра.

Другим препятствием для проникновения лазерного излучения в биологические ткани является сильное рассеяние света. Проникая в биоткань или жидкость, свет рассеивается на клетках, мембранах

и органеллах клеток. Так, в большинстве биотканей коэффициенты

рассеяния в оптическом диапазоне составляют 0,5 - 50 см^-1. Это означает, что глубина проникновения даже нерезонансного излуче­ния обычно ограничена несколькими сантиметрами.

Дополнительно заметим, что сильное рассеяние света практиче­ски исключает какие-либо механизмы воздействия, основанные на когерентности лазерного излучения. Напомним, что когерентность света - свойство световой волны сохранять фазу волны вдоль пути распространения (временная когерентность) и вдоль фронта вол­ны (пространственная когерентность). Ясно, что уже первый слой клеток (или даже эпидермиса) разрушает когерентность све­тового поля. Правда, следует заметить, что существуют оригиналь­ные механизмы биологического воздействия лазерного излучения, учитывающие фазу волны (А.Н. Малов [17]); однако, пока они ос­таются несколько умозрительными.

Изложим теперь некоторые экспериментальные факты, касаю­щиеся воздействия лазерного излучения на компоненты клеток.

Лазерное воздействие на белки. Начиная с появления первых лазеров в 60-х годах двадцатого века проводилось большое количе­ство экспериментов по воздействию лазерного излучения на белки в растворах. Было поставлено множество работ по ультрафиолето­вому лазерному воздействию на белки, содержащие резонансно поглощающие аминокислоты - триптофан, тирозин, фенилаланин; по нерезонансному воздействию и по резонансному инфракрасно­му воздействию с возбуждением ОН, СН и NH валентных или де­формационных колебаний. Как показали эксперименты, в подав­ляющем большинстве случаев наблюдается один процесс - денату­рация белковых макромолекул. Это легко понять, если учесть, что в нативной рабочей конформации белок может находиться лишь в довольно узком диапазоне условий (температуре, рН среды и т.п.). Вспомним, что любое возбуждение в конденсированных средах (см. гл. 2 и 3) так или иначе быстро релаксирует в тепло. Денатура­ция белка как раз и представляет собой переход из рабочей глобу­лярной конформации (т.е. довольно плотной) в состояние стати­стического клубка. Примером денатурации может являться изме­нение состояния яичного белка при нагреве. Таким образом, ос­новное действие лазерного излучения в этих случаях - разрушение рабочей конформации белков.

В середине восьмидесятых годов появилась новая интересная гипотеза о возможности существования колебательных солитонов в макромолекулах белков (так называемые солитоны Давыдова). Напомним, что солитон представляет собой устойчивую уединен­ную волну, обладающую свойствами, подобными частицам. Физи­ческая причина такой устойчивости солитонов - конкуренция дис­персионного расплывания волнового пакета и сжатия, вызванного нелинейностью среды. Давыдов показал, что если в уравнении для колебательного возбуждения в полимерной цепочке, приближенно описываемом квадратичными потенциалами (см. выше - потенциал Морзе), в порядке следующего приближения учесть кубический член, то получится уравнение, известное в теории солитонов как кубическое уравнение Шредингера. Понятно, что существование таких солитонов означает возможность концентрирования энергии возбуждения в каких-то выбранных областях белка на длительное время. Однако многие эксперименты с использованием антисто­ксова рамановского рассеяния, когерентного антистоксова рассея­ния света (КАРС) и т.п. так и не обнаружили солитонов Давыдова.

Другой интересной особенностью белка является принципиаль­ная возможность длительного существования неравновесного рас­пределения колебательного возбуждения между различными структурными элементами макромолекул: альфа-спиралями, складками и т.п. В экспериментах автора в середине девяностых годов было показано (методом антистоксова рамановского рассея­ния), что при резонансном лазерном возбуждении ОН-колебаний в альбуминах распределение возбуждения сильно отличается от СН- возбуждения (такого же по всем термодинамическим параметрам). Таким образом, нельзя исключить существования довольно тонких механизмов воздействия лазерного излучения на конформации белков; однако этот вопрос еще далеко не исследован [18].

Лазерная генетика. Вопреки распространенному убеждению, что ультрафиолетовое излучение всегда влияет на ДНК и на геном, следует заметить, что эксперименты, все-таки, в общем случае не подтверждают этого. Правда, еще с прошлого века хорошо извест­но бактерицидное («убивающее» бактерии) действие ультрафиоле­тового излучения. Сегодня почти в каждой клинике производят стерилизацию (так называемое «кварцевание») операционных и процедурных помещений с применением ультрафиолетовых ламп (как правило, дейтериевых или ртутных). Такое бактерицидное действие традиционно связывают с разрушением ДНК микроорга­низмов, поскольку именно ДНК обладает достаточно большими сечениями поглощения. Это, разумеется, так, но разрушение обыч­но достигается только очень большими дозами облучения.

Как показывают эксперименты, сходным образом действует и лазерное УФ-излучение. Так, в опытах Chilbert и др. ([19]) под дей­ствием эксимерного лазера наблюдалось разрушение конформации двойной спирали в ДНК и образование циклических полинуклео­тидов, причем только при очень больших дозах облучения (> 100 Дж на микрообразец). Образование этих продуктов может говорить о возможной предиссоциации полинуклеотидов (помимо тепловой диссоциации) при таком воздействии. Примечательно,

что этот эффект зависит только от дозы, но не от интенсивности

излучения - это проверялось специально.

В 2005 г. в университете Огайо в США (Kohler и др.[20]) с по­мощь фемтосекундного лазера удалось точно измерить характер­ные времена жизни электронно-возбужденных состояний в ДНК. Оказалось, что эти времена меньше одной пикосекунды. Авторы сочли это «естественным механизмом защиты ДНК от ультрафио­летового повреждения». Ясно, что интенсивности света, преодоле­вающие такую быструю релаксацию in vivo недостижимы.

Одна из немногих работ, в которой действительно обнаружива­ется модификация генома лазерным излучением была проделана в 2005 г. с помощью микроскопического «лазерного прокалывания» (puncture) мембран отдельных зародышевых клеток пшеницы (Badr и др.) [21]. Это делалось с помощью острой фокусировки излуче­ния УФ эксимерного лазера в оптическом микроскопе. При этом мембраны быстро самовосстанавливались, а ДНК ядра получало дозу облучения. В результате появлялись жизнеспособные клетки с измененным геномом. Изменение генома затем исследовалось от­дельно. Результат показан на рис. 7.7.

Думается, что этот эффект может быть связан не столько с воз­действием непосредственно на ДНК, сколько, скорее, с модифика­цией каких-то генетических механизмов, обеспечиваемых другими молекулами.

Рис. 7.7. Изменение генома при лазерном «пунктировании» клеток пшеницы (Badr et al, 2005)

Итак, пока каких-то избирательных механизмов модификации генома лазерным излучением, похоже, пока не найдено. Однако

нам уже сейчас ясен основной механизм лазерного действия на

биологические объекты (обратные связи «излучение - продукт») и ясны физические условия его реализации. Может быть со временем такие механизмы будут использоваться в молекулярной генетике; здесь - огромные перспективы. Несмотря на это, пока удручающе мало исследований с применением описанного механизма к кон­кретным (известным) биохимическим процессам. Зато процветает другая область лазерной медицины: воздействие низкоинтенсивно­го лазерного излучения.

Терапевтическое действие низкоинтенсивного лазерного из­лучения. В отечественной медицине считается клинически дока­занным лечебное действие низкоинтенсивного лазерного излуче­ния (интенсивности ~ мВт/см²) с длиной волны излучения в крас­ной области (~ 600 - 800 нм). Чаще всего для этих целей использу­ется излучение самых доступных гелий-неоновых лазеров (633 нм) или полупроводниковых лазеров (700 - 900 нм). Терапевтическое действие такого излучения относится к наиболее загадочным во­просам лазерной медицины.

Сразу заметим, что исследования лечебного действия такого из­лучения и применение его в медицинской практике проводятся только в нескольких странах: в России, и (в меньшей степени) в Израиле, Японии, Китае и Латинской Америке. В США, Канаде и Западной Европе и других странах мира интерес к этим методам практически отсутствует.

Одной из причин этого является тот факт, что эффекты такого воздействия почти неотличимы от эффектов плацебо. В медицине плацебо называется препарат, внешне неотличимый от лекарства (таблеток и т.п.), но не содержащий никаких лекарственных ве­ществ. Прием такого препарата больным, убежденным в том, что это лекарство, как теперь твердо доказано, вызывает заметный ле­чебный эффект. Причиной этого, по всей вероятности, является психосоматический эффект или самовнушение.

Термин «плацебо» был введен в медицине еще в 1894 г. Однако эффект плацебо начал учитываться только в 30-е годы XX в., после введения предложенного Брэдфордом Хиллом метода рандомизи­рованных испытаний любого лекарственного препарата. Суть ме­тода состоит в том, что действие лекарства на какой-то группе па­циентов должно обязательно сравниваться с действием плацебо на контрольной группе. Только различие в результате воздействия на основную группу и контрольную группу пациентов говорит о ле­карственных свойствах препарата. Любопытно, что в настоящее время больше половины используемых лекарственных средств так и не прошли рандомизированного исследования. Сейчас (в начале XXI в.) проведены масштабные исследования этого эффекта в США и Европе. Получены интересные результаты: оказалось, что почти все лекарственные препараты, использовавшиеся в XIX в. и не менее половины в XX в. действовали по механизму плацебо. Другой, важный для нас результат состоит в том, что эффект пла­цебо практически не работает при лечении инфекционных забо­леваний, а также травм, ран (2) и т.п.

Конечно, рандомизированные исследования в нашей стране проводились и по отношению к низкоинтенсивной лазерной тера­пии. Результат оказался разочаровывающим. Обобщение большого материала, основанного на применении плацебо (когда больной проходил как бы весь курс лечения, но лазер не включали) и двой­ного слепого контроля (когда о том, где плацебо, а где лазер, не знали ни больной, ни лечащий врач), показало во многих случаях отсутствие статистически достоверных улучшений в состоянии больного. В тех же случаях, когда лечебный эффект был, врачи жаловались на очень плохую воспроизводимость результатов, раз­личия в чувствительности к облучению у разных больных, опас­ность передозировки, когда лечебный эффект облучения сменялся неблагоприятным действием.

Итак, с высокой вероятностью, механизм лечебного действия низкоинтенсивного лазерного излучения может сводиться к эффек­ту плацебо. На этом можно было бы закрыть эту тему, однако, как оказалось существуют некоторые факты, показывающие, что ле­чебное действие такого излучения действительно возможно. Во- первых, большое число успешных применений излучения относи­лось к заживлению послеоперационных ран, когда, как упомина­лось выше, обычный эффект плацебо обычно не работает. Во- вторых, биохимический анализ клеток, подвергавшихся облучению in vitro, объективно показывает некоторое изменение химического состава. Есть ряд других, еще более косвенных подтверждений возможности лечебного эффекта низкоинтенсивного лазерного излучения, не связанного с эффектом плацебо.

В связи с этим, а также с высокой вероятностью встречи в прак­тической работе нашего специалиста с такими методами лечения, приведем объективные факты и основные гипотезы низкоинтен­сивной лазерной терапии.

Прежде всего, приведем список примеров успешного примене­ния такой лазерной терапии: облучение крови и суставов при рев­матоидном артрите, лечение мужского бесплодия, глазных болез­ней, включая глаукому, дисфункции мочевого пузыря, ишемиче­ской болезни сердца, кожных болезней и болезней крови, осложне­ний при хирургических травмах, пиелонефрита, плацентарной не­достаточности, туберкулеза легких, подготовка больных к хирур­гическим вмешательствам, лечение опухолей и др.

По мнению врачей, главной проблемой в области лазерной те­рапии является отсутствие научного объяснения наблюдаемых по­ложительных (и отрицательных) эффектов лазерного облучения. По формулировке Ю.А. Владимирова из РГМУ [22], «не понимая, что происходит, нельзя правильно лечить».

Объективно установлены следующие факты [22].

1. Излучение с длиной волны 400 - 500 и около 600 нм вызыва­ло увеличение скорости деления клеток некоторых микроорганиз­мов, а также увеличение белкового синтеза. При этом наблюдалась выраженная экстремальная зависимость стимулируюшего действия лазерного облучения от дозы; интервал интенсивностей, в пределах которых наблюдался положительный эффект, составлял полтора- два порядка величины.

2. При облучении изолированных митохондрий печени светом гелий-неонового лазера в них увеличивалось содержание АТФ, электрический потенциал на внутренних мембранах и рН в матрик­се, а также наблюдаются небольшие изменения формы матрикса.

3. Облучение клеток-фибробластов человека светом гелий­неонового лазера существенно увеличивало скорость роста по­пуляции клеток в экспоненциальной фазе (как говорят, пролифера­цию клеток) и (в случае эмбриональных фибробластов) адгезию клеток на подложке.

4. Лазерное облучение клеток, выделенных из эпителия сетчат­ки, приводило к увеличению митотического индекса (митотиче­ский индекс - показатель митотической активности ткани или культуры ткани, представляющий собой число делящихся клеток из 1000 изученных на гистологическом препарате.).

5. Под действием облучения гелий-неонового лазера увеличива­лось содержание внутриклеточного кальция в лейкоцитах, окраши­вание нуклеиновых кислот в клетках флуоресцирующим красите­лем (акридиновым оранжевым) и изменение морфологической структуры хроматина. По всем параметрам действие лазерного излучения в оптимальной дозе было сходным с действием вещест­ва - фитогемагглютинина.

6. При облучении крови непосредственно в кровеносных сосу­дах наблюдалось расширение сосуда выше и ниже места облуче­ния; эффект исчезал при замене крови перфузируемым физиологи­ческим раствором. Этот эффект (вазодилатация) приводит к улуч­шению кровоснабжения органов.

Таким образом, все наблюдаемые в клинике эффекты (противо­воспалительное действие лазерного облучения, ускорение регене­рации поврежденных тканей и улучшение кровоснабжения орга­нов) могут быть связаны с тремя эффектами, полученными в экс­перименте:

1) ростом активности фагоцитов;

2) усилением пролиферации клеток;

3) улучшением циркуляции крови по сосудистому руслу вслед­ствие расслабления стенок кровеносных сосудов (вазодилатации).

Главная проблема, не позволяющая пока детально объяснить эти наблюдения - отсутствие какого-либо вещества, заведомо уча­ствующего в этих процессах и эффективно поглощающего излуче­ние гелий-неонового лазера. Несмотря на неясность с акцептором излучения, далее предполагаются чисто химические механизмы (что естественно, поскольку эти исследования находились в руках медиков). Фотохимические механизмы, которые могут обеспечить протекание описанных процессов, в настоящее время более или менее ясны:

1) фотоокисление липидов в клеточных мембранах;

2) фотореактивацию фермента супероксиддисмутазы (СОД);

3) фотолиз комплексов окиси азота (NO).

Как уже отмечалось, чистые фосфолипиды не поглощают свет в видимой и ближней инфракрасной областях спектра, характерных для излучения использованных лазеров. Однако, если к фосфоли­пидам добавить поглощающий свет сенсибилизатор, например ге­матопорфирин или фталоцианин, то под действием света лазера, в частности, гелий-неонового, происходит окисление липидов (фото­динамический эффект), сопровождающееся образованием переки­сей (фотопероксидация). Фотопероксидация липидов наблюдается также и при лазерном облучении суспензии клеток или митохонд­рий, всегда, если добавить сенсибилизатор, а иногда, если даже его не добавлять. По-видимому, в некоторых условиях, в частности при определенных заболеваниях, в мембранах накапливаются при­родные сенсибилизаторы, возможно тот же гематопорфирин или его производные.

Итак, если при каких-то, пока не совсем ясных условиях, возни­кает накопление природного фотосенсибилизатора, то дальнейшие биохимические эффекты, в общем, на сегодня понятны. Добавим, что изучение этих механизмов позволило объяснить наиболее ха­рактерную черту низкоинтенсивной лазерной терапии: кривые за­висимости эффект-доза, имеющие максимум. Характерный вид кривых показан на рис. 7.7. Эффективность воздействия в этих экспериментах контролировалась по величине хемилюминесцен­ции лейкоцитов крови.

Как видим, результаты, в общем, согласуются с выработанными представлениями о существовании естественного сенсибилизатора. Проблема в том, что эти объяснения далеко не единственны. Приве­дем для ознакомления другие модели, столь же успешно объясняю­щие лечебное действие низкоинтенсивного лазерного излучения.

Рис. 7.7. Лазерная стимуляция (прайминг) лейкоцитов, изолированных из крови

больных различными легочными заболеваниями, вызванный лазерным облучени­ем: а - хронический бронхит; б - хроническое воспаление легких; в - тяжелая полисегментная пневмония в острой фазе; 1 - в присутствии искусственного сен­сибилизатора; 2 - без сенсибилизатора

Предполагается, что акцепторами лазерного излучения могут быть:

1) порфирин и его производные [23, 24, 25];

2) молекулы ферментов-антиоксидантов: супероксид-дисмутаза (СОД), каталаза, церулоплазмин [26, 27];

3) компоненты дыхательной цепи митохондрий: флавопротеины и цитохромы [24, 28];

4) молекулярный кислород [30, 31].

Эти вещества, конечно, могут быть акцепторами излучения ге­лий-неонового лазера, однако сечения поглощения при этом для них (за исключением порфиринов) довольно малы. Суммарное количество поглощенных квантов будет столь невелико, что кон­центрация продуктов соответствующей фотохимической реакции должна быть пренебрежимо мала (по сравнению с обычной хими­ческой терапией). Другим контраргументом является тот факт, что сообщалось и о терапевтическом действии низкоинтенсивного ла­зерного излучения других длин волн: в зеленой части спектра (514 нм) и инфракрасной (950 - 1000 нм). В этом случае эффект уже не может связываться с поглощением порфиринами и т.п.

Также предлагается большое количество механизмов, приводя­щих к терапевтическому эффекту:

1 - реактивация металлосодержащих ферментов-антиокси­дантов [31, 32, 26, 27];

2 - гипотеза о взаимодействии низкоинтенсивного лазерного из­лучения с компонентами цепи транспорта электронов в митохонд­риях [21, 28];

3 - неспецифическое влияние на биополимеры [26];

4 - фотовозбужденное образование синглетного кислорода [29,

30];

5 - неспецифическое влияние на структуру воды [30].

Мы не будем подробно рассматривать все эти механизмы, отме­тим только общие черты: во-первых, все эти механизмы удовле­творительно объясняют наблюдаемые эффекты; во-вторых, против всех этих механизмов существуют очень серьезные контраргумен­ты; в-третьих, существуют факты, подтверждающие тот или иной механизм, но носящие обычно косвенный характер.

В заключение приведем еще одно очень простое соображение. Мы видели, что когерентность лазерного излучения не может быть существенной для лечебного эффекта (ее просто нет при распро­странении света в биотканях). Тогда, единственное, чем может

отличаться лазерное воздействие от простого солнечного света - это спектральная яркость излучения. Но мы видим, что эффекты

вовсе не специфичны по длинам волн, т.е. почти не зависят от спектра света. Заметим, что в яркий солнечный день интенсивность света (до 50 мВт/см²) может быть даже выше интенсивности, ска­жем, гелий-неонового лазера. Однако, почему-то никто не считает, скажем, простое пребывание в освещенной комнате в течение не­скольких минут медицинской процедурой, эффективно излечи­вающей массу серьезных заболеваний.

Практические применения лазерного излучения в медицине.

Помимо рассмотренного терапевтического действия низкоинтен­сивного лазерного излучения, существует ряд более простых и об­щепризнанных применений лазеров в медицине.

Механическое действие лазерного излучения, «лазерный скаль­пель». При достаточно высоких интенсивностях излучения, в до­плазменном режиме или даже выше порога плазмообразования, нагрев поверхности может достигать столь высоких величин, что вызывает фазовые переходы, испарение или последующую иониза­цию вещества в лазерном поле (с образованием факела плазмы). Это приводит к абляции (т.е. «выносу») большого количества ве­щества с поверхности. Метод удаления вещества с помощью ин­тенсивного лазерного излучения используется в хирургии в качест­ве скальпеля. Первичный физический процесс здесь, по-видимому, все-таки чисто тепловой. Это подтверждается тем, что наиболее эффективно для этих целей непрерывное или импульсно­периодическое излучение, которые приводят к значительному на­греву. Лазерная специфика здесь связана лишь с двумя факторами: монохроматичностью одномодового излучения позволяющей по­лучить очень малые размеры пятна фокусировки излучения и им­пульсно-периодическим режимом при наносекундных импульсах, что позволяет создать режим сильного нагрева поверхности, при котором средний нагрев ткани не слишком велик, но на поверхно­сти достаточен для протекания абляции. Это выгодно отличает лазерный скальпель от, например, радиочастотного ВЧ-скальпеля.

В медицинских публикациях сообщается о значительно лучшем заживлении послеоперационных ран при использовании лазерного скальпеля вместо обычного. Причины такого эффекта пока не очень ясны. Возможно, при использовании излучения просто меньше травмируются окружающие ткани. Чисто плазмохимиче­ское действие лазерного излучения пока мало изучалось.

Добавим, что эти эффекты (т.е. разница в действии лазерного и обычного скальпеля) обычно не очень велики и часто нестабильны. Если учесть, что лазерная техника является довольно дорогостоя­щей, то понятно, что вряд ли следует ожидать бурного развития таких методов. Заметим, что, пользуясь методами, изложенными в предыдущих главах, читатель вполне сможет моделировать такое действие излучения.

Лазерная фототерапия и фотодинамическая терапия. В фото­динамической терапии обычно используется какая-либо заранее известная фотохимическая реакция (например, одноквантовая фото­диссоциация связей или химическая реакция молекул в возбужден­ном состоянии) в определенном веществе, которое вводится в орга­низм извне. Подобные методы уже имеют успех, например, в онко­логии. Чаще всего в организм вводятся молекулы производных пор­фирина, накапливающиеся, как показано, в определенных клетках, которые следует разрушить (например, в метастазирующих тканях). Из этого механизма (определенно одноквантового) ясно, что эффект пропорционален только дозе облучения, но не интенсивности. (Вы­ход одноквантового эффект, конечно, растет с увеличением интен­сивности, но только за счет того, что при большей интенсивности за то же время облучения набирается большая доза. Иными словами, при фиксированной дозе эффект не зависит от интенсивности излу­чения.) Это означает, что использование лазерного излучения в фо­тодинамической терапии могло бы дать какое-то количественное, но

не качественное преимущество. Однако, как оказалось, этого тоже

не происходит - при помощи ламп дозу можно набрать даже быст­рее. Поскольку для фотодинамической терапии не требуются высо­кие интенсивности излучения, то, возможно, монохроматичность лазерного излучения дает какой-то выигрыш в эффекте? Нет, по­скольку сложные молекулы и так обладают широкими полосами поглощения. Как следствие, использование значительно более деше­вых ламповых источников света с широким спектром позволяет да­же легче набрать необходимую терапевтическую дозу облучения.

Таким образом, использование лазеров в фотодинамической терапии пока также не очень перспективно.

Резюмируем сказанное. Итак, если оставить в стороне простей­шие применения лазеров, то лазерное воздействие на биологиче­ские объекты по механизму, аналогичному лазерному управлению химическими реакциями (образование новых обратных связей и т.п.) имеет огромные перспективы применений в медицине. Однако здесь необходимы серьезные фундаментальные исследования. К сожалению, в нашей стране они пока почти полностью подавляют­ся гиперактивностью в области низкоинтенсивной лазерной тера­пии. Проблема здесь, конечно, не в том, что широко проводятся именно такие исследования. Просто с течением времени, очевидно,

возникнет неизбежное разочарование в возможностях низкоинтен­сивной терапии (как говорят, сменится мода) и это - столь же неиз­бежно! - вызовет тотальное недоверие вообще ко всем методам лазерной терапии. Естественно, этого хотелось бы избежать.