03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология
Согласно современным представлениям, атеросклероз является многопричинным заболеванием, затрагивающим многие физиологические и патологические механизмы. Среди факторов, на сегодняшний день установленных, ~ генетическая предрасположенность, условия гемодинамики в отдельных участках сосудистого русла, комбинации различных риск-факторов (гиперхолестеринемия, артериальная гипертензия, сахарный диабет), иммунные и аутоиммунные нарушения, вирусная инфекция и т.д. [Wick et al, 2001; Najemnick et al, 1999; Landmesser et al, 2000; Benitez, 1999; La Rossa, 1998; Gimbrone, 1999; Libbi, Hansson, 1991]. Обычно, бывает трудно ответить на вопрос, что же явилось основной причиной развития заболевания.
Многочисленные попытки объяснения патогенеза атеросклероза у человека вылились в создание целого ряда теорий возникновения этого заболевания. Еще в начале 1850-х годов Rokitansky предположил, что отложение фибрина в участках поврежденной сосудистой стенки может вызывать образование атеросклеротичес-кого поражения. Немногим позднее, Virchow указал, что накопление липидов в сосудистой интиме способствует пролиферации клеток и развитию атеросклероза. В дальнейшем, Аничков разработал холестериновую модель атеросклероза у кроликов и определил атеросклероз, как хроническое заболевание, характеризующееся первичным отложением липидов в стенке артерий, вторичным реактивным разрастанием соединительной ткани, и как следствие - образованием склеротических утолщений-бляшек [Anitchkov, 1913]. В последующие годы был предложен целый ряд концепций, из которых наибольшее распространение получила теория Ross [1976, 1986], предполагающая, что атеросклероз является результатом повторного повреждения эндотелия, сопровождающимся адгезией тромбоцитов, их активацией на обнаженной субэндотелиальной поверхности и миграцией макрофагов в интиму. В результате - образование пенистых клеток макрофагального происхождения, миграция и пролиферация гладкомышечных клеток (ГМК), синтез и депонирование внеклеточного матрикса, фиброзирование ткани. Тем не менее, присутствие в эндотелиальной выстилке обширных участков деэндотелиализации было опровергнуто результатами многих исследований [Schwenke, Carew, 1989; Witztum, 1990; Sitnionescu, Sitnionescu, 1993].
В этой связи, под "повреждением" эндотелия в настоящее время принято понимать не механическую денудацию, а сложный комплекс изменений внутриклеточного метаболизма, приводящих к "дисфункции" эндотелиальных
клеток [Ross, 1992; Gimbrone et al, 2000; Toborek, Kaiser, 1999; Shimokawa, 1999]. Сюда можно отнести изменение барьерной функции [Lum, Malik, 1994], нарушения регуляции сосудистого тонуса [Vanhoutte, Mombuli, 1996], фибринолитической активности [Mann, 1997], иммунологических и про-воспалительных параметров клеток и т.д. [Libbi, 1991; Hill, 1997; Gown et al, 1986]. Последствиями дисфункции эндотелиальных клеток (ЭК) могут являться нарушенная реактивность сосудов и вазоспазм, адгезия, трансмиграция и накопление в интиме клеток гематогенного происхождения, нарушение пролиферативной/секреторной функции сосудистых ГМК, а также нарушение процессов регенерации самих ЭК.
Актуальность исследования. Морфологическая гетерогенность ЭК магистральных сосудов по размеру клеток, содержанию белка и плоидности является одной из наиболее ярких отличительных черт эндотелия человека от эндотелия экспериментальных животных. Еще в 1950-е годы было отмечено, что единичные многоядерные ЭК появляются уже в детском возрасте, и в дальнейшем их содержание неуклонно возрастает, достигая десятков процентов в сосудах взрослых людей [Каменская, 1952]. Наибольшее развитие изучение морфологической гетерогенности эндотелия получило в конце 1970-х - начале 80-х годов, когда об этом явлении впервые заговорили, как о процессе, возможно связанном с атерогенезом. Увеличение относительного содержания гигантских многоядерных или, так называемых, "вариантных" ("variant") ЭК в пораженных атеросклерозом сосудах и возрастные корреляции подвели к предположению о том, что эти клетки, возможно, и являются искомым морфологическим базисом атеросклероза [Вихерт, Розинова, 1981, 1983; Repin et al, 1984; Antonov et al, 1986; Tokunaga et al, 1989; Watanabe, 1990; Wu et al, 1999]. Тем не менее, несмотря на длительно повышенный интерес к этой популяции, до настоящего времени никому из исследователей так и не удалось выявить каких-либо существенных метаболических изменений, свойственных данной клеточной разновидности, впрочем, как и полностью отрицать их вовлечение в атерогенез [Wu et al, 1999; Satoh et al, 1998; Tokunaga et al, 1998].
Еще одной, крайне интересной формой морфологической гетерогенности эндотелия магистральных артериальных сосудов человека, является способность ЭК формировать группы - т.н. кластеры, состоящие из клеток приблизительно одного размера и формы. Завидное постоянство, с которым кластеризованный эндотелий выявляется в зонах, предрасположенных к развитию атеросклероза, и участках, окружающих уже существующие атеросклеротические бляшки, свидетельствует, что
эта форма гетерогенности может иметь непосредственное отношение к процессам атерогенеза [Романов, 1989; Романов, Антонов, 1991; Romanov etal, 1995,1999].
В последние годы все больше внимания уделяется возможной взаимосвязи патогенеза атеросклероза и воспаления в сосудистой стенке [Plutzky, 2001; Koenig, 2001; Ross, 1999; Robbie, Libby, 2001]. Это связано с тем, что в механизмах развития различных форм сосудистой патологии, таких как васкулиты, отторжение трансплантата, ишемия-реперфузия и т.п., есть много общего. Адгезия циркулирующих в крови клеточных элементов на эндотелий и их трансмиграция в субэндотелиальные слои интимы является неотъемлемым компонентом многих острых и хронических воспалительных реакций и одним из наиболее ранних событий атерогенеза [Ross, 1999; Faggiotto et al, 1984; Munro, Cotran, 1988].
Основная физиологическая роль миграции клеточных компонентов крови в сосудистую стенку и подлежащие ткани заключается в участии лейкоцитов в различных механизмах защиты организма. Нейтрофилы одними из первых появляются в очаге поражения для нейтрализации патогенного стимула. В дальнейшем, к ним присоединяются лимфоциты, определяющие локальный иммунный ответ и модуляцию иммунитета в целом. Совместные действия различных клеточных популяций заканчиваются, обычно, устранением патогена и репарацией повреждения. При этом, наряду с положительными эффектами присутствия клеток крови, их биологическая активность может иметь и отрицательные стороны, вследствие нарушения баланса метаболических процессов в сосудистой стенке. Одной из причин Инегативного" поведения клеток крови в интиме является их высокая синтетическая и секреторная активность [Cassatella, 1995]. Уже в процессе взаимодействия с эндотелием клетки крови частично активируются [Zimmerman et al, 1992; Lorant et al, 1991]; их дальнейшая судьба определяется микроокружением, т.е. как минимум, двумя факторами: межклеточным матриксом и комплексом биологически активных молекул, продуцируемых а) ими же самими, б) эндотелием, в) ГМК.
Вся последовательность дальнейших событий в интиме возможна лишь при одном условии: существовании участков функционально измененного, активированного эндотелия, экспрессирующего молекулы, участвующие в привлечении гематогенных клеток. Подобные условия, по-видимому, имеют место на начальных стадиях атерогенеза. Исследования экспрессии различных классов молекул клеточной адгезии (МКА) эндотелием показали присутствие в эндотелиальной выстилке участков, экспрессирующих эти белки, в случаях, как экспериментального атеросклероза у животных, так и в сосудах человека [Cybulsky,
Gimbrone, 1991; Poston et al, 1992; O’Brien et al, 1993; Wood et al, 1993]. Одновременно, в субэндотелии были выявлены скопления клеток гематогенного происхождения (макрофагов, лимфоцитов и т.д.). В этой связи однозначно ответить на вопрос о первичности подобных изменений в эндотелии было затруднительно. С одной стороны, клетки гематогенного происхождения, составляющие интимальные инфильтраты, способны индуцировать экспрессию МКА вышерасположенным эндотелием, благодаря продукции про-воспалительных цитокинов и ростовых факторов. С другой, они вряд ли оказались бы в субэндотелиальном пространстве, не пройдя сквозь тот же эндотелий. Так что повышенная экспрессия МКА в локальных участках сосудистого русла является, по-види.мому, первичной.
Среди многочисленных факторов, способных прямо или опосредовано влиять на экспрессию эндотелием различных классов МКА и принимать участие в инициации воспалительных изменений в сосудистой стенке, особый интерес представляют агенты вирусной природы, особенно, представители семейства герпесвирусов. В первую очередь, это относится к двум наиболее распространенным в человеческой популяции вирусам: вирусу простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) и цитомегаловирусу (ЦМВ) [Hajjar, 1991; Persoons et al, 1994; Melnick et al, 1993; Childs et al, 1993]. И тот и другой способны инфицировать клетки сосудистой системы (ЭК и ГМК), вызывая в них комплекс структурных и функциональных изменений. Другой особенностью обоих вирусов является способность формирования латентной инфекции с периодами реактивации, с чем связывают развитие различных осложнений, включая сосудистые, у пациентов, находящихся на иммуносупрессивной терапии. Один из механизмов, лежащих в основе развития воспалительной реакции с участием ВПГ-1-инфицированных ЭК, заключается в способности этого вируса индуцировать экспрессию Р-селектина [Hajjar, 1991], участвующего в инициации взаимодействия ЭК-лейкоцит.
Бесспорным лидером среди агентов вирусной природы, с которыми связывают и развитие атеросклероза, и возникновение трансплантационных осложнений, в основе которых лежат те же клеточные механизмы, является ЦМВ [Persoons et al, 1994; Melnick et al, 1993; Childs et al, 1993]. Как и в случае ВПГ-1, первичная ЦМВ-инфекция клеток сосудистой стенки или реактивация латентного вируса являются триггером в развитии цепи последующих патологических событий. Наибольшее число ЭК и интимальных ГМК, несущих вирусный геном или имеющих признаки реактивации вируса, выявляются в участках наиболее ранних проявлений атеросклеротического процесса [Pampou et al, 2000].
Взаимодействие эндотелия с клетками крови представляет собой лишь часть событий, имеющих место в ходе атерогенеза. Не менее интересным представляется взаимодействие ЭК с основным клеточным компонентом неизмененной интимы - ГМК. Известно, что ЭК способны продуцировать как ингибиторы, так и стимуляторы пролиферативной и синтетической активности ГМК. Последние, в свою очередь, также являются мощным, если не основным, источником цитокинов в сосудистой стенке и способны регулировать метаболизм, как самих себя (аутокринно), так и, по-видимому, выше лежащего эндотелия. Таким образом, в сосудистой стенке существует сложная сеть взаимного ингибирования и активации, участниками которых являются все три разновидности клеток, ее составляющих: эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки и клетки крови.
Еще одним фактором, постоянно действующим на все живые одноклеточные и многоклеточные организмы, является фактор гравитации. Об этом факторе обычно забывают, поскольку он постоянно действует в наземных условиях. Между тем, исследования, проводимые в условиях измененной гравитации в модельных системах и условиях реального космического полета, свидетельствуют, что действие этого фактора (точнее, его практически полное отсутствие) сказывается на функционировании большинства исследованных клеточных типов [Таирбеков, 1997]. Данные о регуляторной функции фактора гравитации и возможным последствиям его изменения для организма человека на клеточной уровне в литературе отсутствуют. Неизвестно даже, существует ли гравитационная чувствительность клеточных элементов сосудистой стенки и не с этим ли связан сложный комплекс негативного влияния невесомости на организм человека.
Цель и задачи исследования. Основная цель данного исследования заключалась в поиске взаимосвязи между особенностями морфологической гетерогенности эндотелия и топографией преимущественного возникновения атеросклеротических поражений в сосудах человека и изучении роли межклеточных взаимодействий с участием основных клеточных компонентов сосудистой стенки в развитии сосудистой патологии. К задачам исследования были отнесены:
1. изучение особенностей организации эндотелия аорты человека в зонах с различной предрасположенностью к атеросклерозу (ІІПА - низкой и ВПА - высокой);
2. адаптация методов выделения и культивирования различных типов клеток сосудистой стенки человека;
3. анализ структурно-функциональных параметров ЭК в культурах, полученных раздельно из зон НПА и ВПА;
4. отработка экспериментальных моделей и исследование особенностей межклеточных взаимодействий с участием различных популяций ЭК в условиях со-культивирования с резидентными и мигрирующими в интиму типами клеток (ГМК и клетками крови);
5. изучение возможных механизмов возникновения некоторых форм гетерогенности эндотелия;
6. поиск функциональных изменений различных популяций ЭК, способных объяснить локальный характер развития атеросклеротических поражений в сосудах человека;
7. исследование роли вирусной инфекции в возникновении популяций функционально измененного эндотелия и особенностей взаимодействия инфицированных ЭК с другими клеточными типами;
8. разработка экспериментальной модели гипогравитации с применением культивируемых ЭК человека и изучение особенностей функционирования эндотелия в измененных условиях.
Иными словами, основным направлением работы был поиск ответа на вопрос: почему атеросклеротические поражения развиваются локально и лишь в определенных участках сосудистой стенки, и какие факторы внешней среды могли бы оказаться решающими в развитии различных форм сосудистой патологии, включая атеросклероз?
Научная новизна. Практически все основные результаты работы получены впервые. Для исследования особенностей организации эндотелиального монослоя в сосудах человека была разработана оригинальная методика импрегнации, основанная на фотографическом усилении контраста межклеточных границ. Использование данного метода позволило отказаться от сканирующей электронной микроскопии, избежать ряда артефактов и использовать для анализа световую микроскопию. Кроме этого, стало возможным анализировать поверхность целого сосуда, практически, невзирая на его толщину и неровность рельефа. Использование данной методики на большой выборке аутопсийных аорт (возраст от 1 месяца до 70 лет) позволило проследить динамику нарастания гетерогенности эндотелия в различных участках сосуда, в том числе, в зонах с различной предрасположенностью к атеросклерозу (НПА и ВПА).
Впервые установлено, что особенностью эндотелия в зонах ВПА являются опережающие темпы нарастания морфологической гетерогенности, содержания гигантских ЭК (в среднем вдвое по сравнению с зонами НПА тех же сосудов) и изменение организации монослоя, проявляющееся в кластеризации клеток близкого
размера и формы. Впервые удалось связать морфологические особенности эндотелия с топографией преимущественного развития атеросклеротических поражений.
Благодаря оптимизации методик выделения и культивирования ЭК, был разработан способ получения высоко репрезентативных культур эндотелия из зон с различной предрасположенностью к атеросклерозу и участков с различной степенью атеросклеротического поражения.
При культивировании клеток в присутствии 3Н-тимидина впервые было установлено, что многоядерные ЭК неспособны к синтезу ДНК и пролиферации, что характеризует эту популяцию как покоящуюся и, возможно, терминальную стадию развития эндотелия. Анализ пролиферативной активности ЭК в культурах из зон НПА и ВПА позволил впервые установить, что возникновение атеросклеротических поражений коррелирует со значительным снижением пролиферативной активности клеток. Полученные данные явились первым доказательством существования функциональных, связанных с атеросклерозом различий клеток в зонах с различной предрасположенностью к заболеванию. Дальнейший анализ культур позволил выявить более высокую чувствительность ЭК в культурах из зон ВПА к действию повреждающих факторов и более низкую, по сравнению с клетками из зон НПА, активность аденилатциклазиой системы. Впервые показано, что длительная гипертермия вызывает повреждение культивируемых ЭК, способствует возникновению морфологической гетерогенности эндотелия и может рассматриваться, как дополнительный фактор риска развития сосудистой патологии.
При моделировании межклеточных взаимодействий с помощью со-культиви- рования ЭК и ГМК было установлено, что способностью тормозить пролиферацию ГМК обладают лишь клетки, выделенные из зон НПА нормальных аорт. Клетки из зон ВПА тех же аорт практически не влияли, а клетки из атеросклеротических сосудов иногда даже стимулировали пролиферативную активность ГМК. Полученные данные впервые показали, что межклеточные взаимодействия ЭК и ГМК нарушаются в зонах ВПА уже на ранних этапах атерогенеза и могут быть вовлечены в формирование атеросклеротической бляшки.
Впервые показано, что в составе эндотелиальной выстилки аорты человека присутствуют клетки с высоким запасом пролиферативного потенциала ("камбиальные" ЭК, колониеобразующие единицы эндотелия, тканевые клетки- предшественники), способные формировать дискретные клеточные колонии (клоны) при низкой плотности посадки в культуру. Число таких клеток составляет всего от долей до единиц процентов и всегда ниже в культурах из зон ВПА. Наименьшее
число колониеобразующих ЭК было выявлено в культурах из атеросклеротических зон ВПА, где их содержание составляло всего 1-3 на 1000 посаженных клеток.
Впервые была сформулирована гипотеза о клональной природе кластеров ЭК in situ и их возможной функциональной неоднородности. В подтверждение, была разработана культуральная модель, с помощью которой впервые удалось воспроизвести в культуре гетерогенный кластеризованный монослой ЭК, состоящий из морфологически и функционально различающихся клеточных популяций.
В холе экспериментов, проведенных с одним из наиболее распространенных в человеческой популяции ДНК-содержащих вирусов - вирусом простого герпеса 1 типа (ВПГ-1), удалось прояснить некоторые механизмы нарушения межклеточных взаимодействий с участием ВПГ-1-инфицированных клеток. Полученные данные подтвердили предположение, что вирусная инфекция эндотелия может являться инициирующим фактором в развитии воспалительного процесса и появлении субэндотелиальных инфильтратов, состоящих из клеток гематогенного происхождения, т.е. способствовать возникновению и прогрессии атеросклероза.
Отдельный раздел исследования был посвящен изучению функционирования эндотелия человека в условиях гипогравитации в модельной наземной системе. Полученные данные впервые показали высокую чувствительность культивируемых ЭК человека к изменению гравитации, связанную с изменением структуры актинового цитоскелета, пролиферативной активности, клеточной подвижности, экспрессии различных классов МКА и взаимодействия с клеточными элементами периферической крови.
Научно-практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные позволяют расширить сложившиеся представления о клеточных механизмах развития сосудистой патологии и атеросклероза у человека. Разработанные методические приемы позволяют использовать культуры ЭК человека для проведения исследований в различных областях клеточной биологии эндотелия, изучения структурных изменений эндотелия экспериментальных животных при различных воздействиях и формах патологии, исследования различных аспектов межклеточных взаимодействий с использованием культивируемых клеток человека и животных.
Разработанная методика импрегнации межклеточных границ с последующим анализом препаратов с помощью световой микроскопии может быть успешно применена при исследовании эндотелия, выстилающего, как крупные артериальные и венозные сосуды, так и мелкие их ветви, вплоть до капилляров.
Разработанная модель оценки структурно-функциональных параметров ЭК при инфицировании ВПГ-1 может быть использована для изучения широкого спектра вирусных инфекций человека, в том числе, других представителей семейства герпесвирусов, вирусов гепатита и др., оценки эффективности новых и уже существующих противовирусных препаратов, тестирования различных биологически активных веществ и т.д.
Разработанная модель изучения эффектов гипогравитации с использованием культивируемых ЭК может быть рекомендована для изучения эффектов гипо- и микрогравитации на любых типах клеток человека и экспериментальных животных, культивируемых в прикрепленном состоянии. Результаты исследований, полученные на культивируемых ЭК, могут быть приняты во внимание при разработке методов профилактики осложнений со стороны сердечно-сосудистой и других систем у космонавтов, длительное время пребывающих в состоянии невесомости на орбитальных станциях.
Результаты исследования были представлены в виде устных и стендовых сообщений на международных конгрессах и симпозиумах: 62nd European Atherosclerosis Society Congress (Иерусалим, Израиль, 1993 г.); 3rd Saratoga International Conference on Atherosclerosis (Токио, Япония, 1993 г.); 8,h International Symposium on the Biology of Vascular Cells (Гейдельберг, Германия, 1994 г.); European Section Meeting of the International Society for Heart Research (Копенгаген, Дания, 1994 г.); Iя US-Russia Joint Symposium on Vascular Biology and Cellular Differentiation (Даллас, США, 1994 г.); 6,h International Congress on Cell Biology &. 36* American Society of Cell Biology Annual Meeting (Сан Франциско, США, 1996 г.); Inaugural Meeting of the European Society for Clinical Virology, Progress in Clinical Virology III (Колония, Италия, 1997 г.); 4th Annual Scandinavian Atherosclerosis Conference (Хамлебек, Дания, 1997 г.); 11th International Symposium on Atherosclerosis (Париж, Франция, 1997 г.); Iя Congress of the Asian-Pacific Society of Atherosclerosis and Vascular Disease (Таипеи, Тайвань, 1998 г.); 13th International Symposium on Drugs Affecting Lipid Metabolism (Флоренция, Италия, 1998 г.); Vascular Biology *98 (Сан Франциско, США, 1998 г.); XIII International Symposium on Drugs Affecting Lipid Metabolism (Флоренция, Италия, 1998 г.); Annual Meeting of the International Society for Interferon & Cytokines (Париж, Франция, 1999 г.); 20th Annual Gravitational Physiology Meeting (Орландо, США, 1999 г.); 21я and 22nd Annual Gravitational Physiology Meeting (Нагойя, Япония, 2000; Будапешт, Венгрия, 2001); XII Международной конференции по космической биологии и авиакосмической медицине (Москва, 2002 г.) |
